研究課題
本研究では、ES細胞由来の眼杯様構造が自己組織的に極性を形成する分子メカニズムについての解明を目的としている。本年度はまず、マウス眼杯の極性マーカーであるVax2およびTbx5を特異的に認識する抗体を作製することを行った。Vax2は眼杯の腹側で、またTbx5は眼杯の背側で発現するマーカーである。それぞれのポリクローナル抗体を得るためにウサギおよびモルモットに抗原を投与し、血清からそれぞれのタンパク質を特異的に認識する抗体を得た。得られた抗体を用いてマウス胚凍結切片を免疫染色した結果、眼杯でのVax2およびTbx5の特異的な発現パターンと同様の染色パターンを得ることができた。作製した抗体を用いて、ES細胞からin vitroで分化した眼杯を染色した結果、Tbx5とVax2は相互排他的に眼杯の違う領域に発現していることが明らかになった。このことはレンズや問葉系細胞などの多の組織がない状況において、網膜神経上皮には自発的に背腹軸の極性を獲得できるメカニズムが存在することを示している。眼杯の背腹方向の極性形成機構をさらに詳細に解析するために、Tbx5遺伝子の発現動態をリアルタイムで観察できるノックインES細胞の樹立をめざした。Tbx5の遺伝視座にtdTomatoを発現するノックインコンストラクトを作製し、Rx-GFPノックインES細胞にエレクトロポレーションにより導入した。その結果、相同組み替えを起こしたES細胞株を得ることができた。さらに、眼杯の形態的な極性と遺伝子の発現パターンとの相関の有無を解析するために、ES細胞から分化させた眼杯の連続切片をTbx5およびVax2の抗体で染色し、三次元再構成を行った。その結果、眼杯の片方には常に切れ目が存在し、三次元形態的に極性を有していることが明らかになった。このような切れ目(fissure)がある側には多くの場合はVax2が発現していた。これらの実験結果から、眼杯の形態および遺伝子発現パターンの極性形成機構には自己組織的な側面が大きく寄与していることを示している。
2: おおむね順調に進展している
当初の予定通り、抗体の作成とノックインES細胞の作成に成功した。また、三次元形態を定量的に解析できる実験系の構築にも成功した。
今後は予定通り、眼杯の三次元形態および遺伝子発現パターンの極性形成過程の4Dイメージングを行う。同時にShhやWntシグナルの定量的な解析を行い。これらのシグナルがどのように眼杯の三次元形態形成に寄与しているのかを明らかにしたい。
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すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件) 学会発表 (3件)
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