| 研究課題/領域番号 |
24680039
|
|---|
| 研究機関 | 岡山大学 |
|---|
研究代表者 |
坂本 浩隆 岡山大学, 自然科学研究科, 准教授 (20363971)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2016-03-31
|
| キーワード | 性機能 / 脳 / 脊髄 / 神経解剖 / 非シナプス的 / ガストリン放出ペプチド / オキシトシン / 神経内分泌 |
|---|
| 研究概要 |
研究代表者はこれまでに、脊髄に存在するガストリン放出ペプチド（GRP）ニューロン系が雄優位な局所神経ネットワークを構築し、雄の性機能を調節していることを見出した。この新規に見出した性機能を司る回路システムと脳との機能的・器質的結びつきについて、現在はさらに脊髄GRP系とオキシトシン（OXT）との機能連関についての解析を進めている。
平成２５年度の実績の概要としては、（１）脊髄GRP系のOXTに対する応答性の解析で、OXTに神経毒（サポリン）と結合させた複合体（ターゲット・トキシンとして）をラット脊髄内に局所投与し、神経解剖学的にGRPニューロンの特異的な脱落を明らかにした。また、効果的な脊髄GRP系の解析系の樹立を目指し、（２）GRPプロモーターの下流に蛍光タンパク質の遺伝子を繋いだトランスジーンを挿入したトランスジェニック（TG）・ラットの作出を行っている。平成２５年度までに、蛍光発光を指標にキャラクタライゼーションを行い、2ラインにまでラインの絞り込みを終えている。さらにin・exo vivo 解析の効率を高める目的で、人工酵素TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）技法を応用し、GRP遺伝子座に赤色蛍光タンパク質遺伝子をノックイン（KI）した、GRP―赤色蛍光タンパク質遺伝子KI・ラットの作出も開始した。平成２５年度に、当該KIラット作出に必要となるGRP遺伝子に特異的なTALENのコンストラクト作製に成功した。さらに、予備的解析から、本コンストラクトは、GRP遺伝子に対するゲノム編集が可能であった。平成２６年度はこのTALENコンストラクトを用いて、実際にKIラットの作出を試みる。
本TGおよびKIラット・ライン確立により、生体でのGRPニューロンの神経生理を解析することが可能になる。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究により種々の新知見を見出すことができ、各種遺伝子改変動物の作出も順調に進んでいるものと判断する。以上の理由から、研究はおおむね順調に進展しているものと自己評価する。
|
| 今後の研究の推進方策 |
平成２５年度に作出したGRP-Venus TGラットについて、キャラクタライゼーション・ラインの絞り込みを進める。さらに、平成２５年度に得られた予備的解析結果を基にして、GRP―赤色蛍光タンパク質遺伝子ノックイン（KI）・ラットの作出を開始する。また、exo vivo 系において脊髄に分布する軸索からのオキシトシンのエキソサイトーシス現象の超微形態学的解析法の確立を進める。現在、マイクロスライサーを用いて急性脊髄スライス (厚さ350－500 um) を作製し、酸素飽和させた人工脳脊髄液 (aCSF) 内で平衡化させた後、高濃度カリウム (56 mM) を含むaCSFで数分間刺激し、エキソサイトーシスを誘発している。その後、脊髄スライスを固定し、定法に従い樹脂包埋を行い、超薄切片を作製し、オキシトシンに対する免疫電顕を行い解析する。平成２５年度までの下垂体後葉を用いた予備的解析で、解析系の確立に成功しているので、平成２６年度は本格的に脊髄スライスの解析、および定量化を目指す。
|
| 次年度の研究費の使用計画 |
遺伝子改変動物の繁殖が予定より進まなかったため。
遺伝子改変動物の系統維持代金として使用する予定である。
|
