研究課題
本研究では、ヒトの細胞（体積：数pL）と同程度の大きさを有するピコリットル空間内に、ヒトの細胞から単離した核を単一核レベル封入し、転写されて核外へ輸送されてくるmRNA（メッセンジャーRNA）を１分子レベルで高精度にカウンティングできる新しいマイクロデバイスと解析法を確立する。これにより、これまでは発現量が極めて低く見落とされていたmRNAも高精度な定量が可能となるため、超早期に細胞の分化やがん化などの検出が可能となることが期待される。25年度は、単一核から転写されるmRNAを１分子レベルで経時的にカウンティングするために必要な可視化技術の検討を進めた。具体的には、高S/N比を有するin stem型モレキュラービーコンの設計とモデル系での反応条件最適化、実サンプルを用いたmRNAの検出を行った。計測対象としてはGAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)など、比較的発現量の多いハウスキーピング遺伝子を中心に行い、相補的なオリゴヌクレオチドに対して特異的かつ高S/N比で結合することを明らかとした。また、HeLa細胞などから抽出したtotal RNAに対するin stem型モレキュラービーコンの反応性について検討したところ、オリゴヌクレオチドと比較してかなり反応性が低くなることが判明した。この原因として、反応溶液のイオン強度や共存するmRNAとの非特異的結合などが考えられた。精度は劣るが定量することも可能であったため、次年度は各細胞の細胞周期である２４時間を目標に経時的かつ定量的データ取得を行う予定である。
2: おおむね順調に進展している
当初の計画通りの実験を遂行し、おおむね期待していた実験項目の検討を終えたため、本研究はおおむね順調に進展していると言える。
当初の予定通り、１分子mRNAの定量的可視化法と経時的可視化法について、細胞の同調培養により核分裂周期を整えることで、より精度の高い評価系構築の検討を進めていく。
当初、蛍光顕微鏡観察に使用する光学フィルターや対物レンズなどの光学部品の購入を検討していたが、既有蛍光顕微鏡からの流用が可能である事が分かったため、次年度使用額が生じた。蛍光顕微鏡によるマイクロチャンバーアレイのスキャニング・イメージングには、光学系のさらなる最適化が必要であるため、これらの光学部品に使用する予定である。
すべて 2013
すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件) 学会発表 (7件) (うち招待講演 2件) 図書 (1件)
Cell Medicine
巻: 6 ページ: 83-90
10.3727/215517913x674270
ACS Nano
巻: 7 ページ: 3029-3035
10.1021/nn4002424
RSC Advances
巻: 3 ページ: 22301-22307
10.1039/C3ra42804d
