研究課題
若手研究(A)
バイオイメージングの発展により、組織や細胞におけるオルガネラの動態を容易に観察できるようになった。その一方で、透過電子顕微鏡(TEM)観察がほとんど行われなくなったため、オルガネラの超微形態は不明瞭な状態である。本研究では、モデル植物を用いて、1、試料を瞬時に固定する高圧凍結技法を改良・高度化し、動的オルガネラを含む高解像度で広域のTEM像を撮影し電算機上に再構築する基盤技術と、2、マルチスケール性を維持した高解像度TEM像上の細胞内構造物に位置情報を自動記録する基盤技術を開発し、組織・細胞におけるオルガネラの超微形態と分布、関連情報を閲覧可能なTEM像のマッピングシステムを構築する。そして、これら基盤技術を用いて、3、発生過程と環境刺激前後の細胞とオルガネラの超微形態を明らかにし、分化発生機構を解明する。今年度は1と2を中心に技術開発を行った。1、良好な凍結固定試料を得る為に、高圧凍結装置を用いて植物根端と培養細胞を凍結後、様々なメーカーのオスミウム結晶を用いて固定して比較し、良好なメーカーの試薬を決定した。樹脂に包埋後、組織全体を含む幅広い超薄切片を作製した。膜を張った1穴グリッドを高真空蒸着装置によりカーボン蒸着し、長時間電子線を照射しても破けにくくする工夫をした。2、TEMを外部PCから電子ビーム方向-試料位置・CCDカメラを制御するプログラムに改良を重ね、広域TEM像の自動撮影システムを構築した。本システムを用いて根端組織や培養細胞の数千～数万枚のTEM像を完全自動で取得することに成功した。さらに、その撮影システムと自動結合プログラムを連動させることで最大15千万ピクセルの広域TEM像の構築に成功した。広域TEM像を用いてオルガネラ自動認証プログラムの開発に着手し、根端のデンプン穎粒の検出に成功した。
2: おおむね順調に進展している
交付申請書に記載した通り1と2の技術検討および技術開発を行い、凍結試料作製法および超薄切片作製法を向上させるとともに、目標としていた数万枚におよぶTEM写真の自動撮影および自動結合に成功した。さらにウェブベース上で拡大縮小およびアノテーション可能なシステムを構築し、試験的にPCやタブレットなどから閲覧可能な仕組みを構築できた。
自動撮影システムおよび自動結合プログラムの精度を向上させる。様々な器官や環境変化に曝した試料の広域に渡る凍結固定を向上させる工夫や技術を開発する。
切片作製用ダイヤモンドナイフの消耗が想定より少なかったため、来年度に新規ナイフの購入または研磨を行う予定である。平成24年度未使用額(1月末現在):1,360,086円
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Methods in Mol. Biol.
巻: (In press)
Protoplasma
DOI10.1007/S00709-012-0469-4
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http://labs.psc.riken.jp/gdrg/Researchl/PSC_bioimaging/Top.html
