| 研究課題/領域番号 |
24687013
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| 研究種目 |
若手研究(A)
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
佐藤 毅 大阪大学, 蛋白質研究所, 助教 (90403013)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | ライゲーション / 固体NMR / 受容体型チロシンキナーゼ / 半合成 |
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| 研究概要 |
平成24年度は繊維細胞増殖因子受容体3(FGFR3)の細胞外領域から膜貫通一細胞質内膜近傍領域に至るタンパク質断片に関して、リガンドの結合に伴った膜貫通一細胞質内膜近傍部位の構造変化を捉えるべく、試料の調製法を確立することを第一の目標とした。すなわち、膜貫通一細胞質内膜近傍領域に部位特異的標識を導入した試料の調製を想定し、当該部位は合成化学的手法によって調製を行い、一方、細胞外領域は大腸菌での発現、精製によって調製する。それらを合成ブロックとして、ライゲーションによって縮合し、目的物を得る予定であった。界面活性存在下での反応であるが、目的物の生成をSDS PAGEゲル上においては確認した。しかし、膜貫通一膜近傍配列ペプチドの化学合成に多くの時間がかかるという問題に直面し、単離するだけの量を獲得するための反応条件の最適化には至らなかった。そこで、この反応条件の検討を効率的に進めていくために膜貫通一膜近傍配列も大腸菌発現系を用いて獲得すべく、その調製法の検討を行った。現時点においては、目的としている配列を獲得するに至っている。
半合成受容体を用いた構造解析実験の前段階として、膜貫通一膜近傍配列ペプチドの脂質二重膜中における構造解析は多くの重要な知見を与える。この実験なしに半合成受容体の標識戦略を決めることは困難である。24年度は、野生型配列と膜貫通部位に常時活性型の変異を導入したものに関して、それらの構造比較解析も行った。その結果、細胞質内膜近傍部位は野生型配列では、膜に結合しているのに対し、変異型では膜から解離することがわかった。膜貫通部位への常時活性型の変異の導入によって膜貫通部位の二量体構造に変化が生じたこと(活性型構造の形成)によって、細胞質内膜近傍部位の挙動に変化が生じた解釈しており、今後の構造解析実験に方向性を与える結果であると考えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
一年目は細胞外領域から膜貫通領域の受容体断片を半合成し、膜への埋め込み法の検討までを行う予定だったが、膜への包埋法の検討には至らなかった。理由は、ライゲーション反応の条件検討を行ううえでの膜貫通配列を有する合成ブロックの調製に多くの時間がかかってしまうところにあったが、この問題に関しては、現在、大腸菌を用いての調製法を検討しており、良好な結果が得られている。実験のスピードアップが期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
細胞外領域におけるリガンド結合による膜貫通一細胞質内膜近傍部位の脂質二重膜中における構造変化を捉えるべく、受容体の半合成、構造解析を行っていくという当初の目的に変更はない。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
当該助成金は生じた理由は、主に研究室に保管してあった比較的古い試薬から実験に用いているためであり、翌年度以降、試薬は買い足して行く予定である。また、実験の進行がやや遅れているため、解析に用いる機器等の購入を見合わせた。解析実験を開始する時期に、新たに購入する予定である。
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