| 研究課題/領域番号 |
24687013
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
佐藤 毅 大阪大学, たんぱく質研究所, 講師 (90403013)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 受容体型チロシンキナーゼ / 半合成 / 膜貫通部位 / 膜近傍部位 |
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| 研究実績の概要 |
H25年度は大腸菌発現系によって調製した細胞外領域合成ブロックの大量調製に向けた条件検討を行い、膜貫通―膜近傍領域を含んだ合成ブロックとの縮合を行うことを第一としていた。各種条件検討を行ったが、収量の改善に至らなかった。大腸菌によって細胞外領域合成ブロックを調製した場合、タンパク質は沈殿画分に存在するため、機能解析実験には当該部位のフォールディングが必要となる。この過程においても、試料のロスは避けられない。従って、H26年度は当該部位の調製ストラテジーを見直し、動物細胞を用いて調製を行うこととした。その結果、HEK293細胞を用い、ライゲーションの合成ブロック、すなわちC末端にチオエステルを有する細胞外領域タンパク質断片の調製に成功した。さらに、その合成ブロックと膜貫通―膜近傍部位を含んだペプチドの縮合にも成功した。
これまでの研究では野生型、常時活性変異型配列に関して膜貫通―細胞質内膜近傍部位に相当するペプチドを化学合成し、脂質二重膜中における構造比較解析を分光学的手法によって行った。細胞質内膜近傍部位に関して、野生型配列では脂質二重膜に結合しているのに対し、常時活性変異型配列では脂質二重膜から解離することを見出した。膜貫通部位に関しては、両配列において異なる会合面を介して二量体を形成すること、並びに膜貫通へリックスの脂質二重膜に対する配向が異なることを示した。これらの結果は論文として発表した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
本研究は、１回膜貫通型受容体に関して、細胞外領域を分子生物学的に調製し、膜貫通部位を含んだタンパク質断片とライゲーションによって縮合する、すなわち半合成することを第一の目的としている。小スケールでの半合成には成功しているものの、大量調製に未だ問題を抱えている。原因は、膜貫通部位を含んだタンパク質断片の調製に関しては、ほとんどの問題を克服したが、細胞領域の調製にある。上述の通り、細胞外領域の調製には動物細胞を用いることによって、比較的多くのフォールドしたタンパク質断片を得ることが期待できる。現段階においても、蛍光測定を行うには十分な量の生成物を獲得している。
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| 今後の研究の推進方策 |
FGFR3の膜貫通―膜近傍部位の脂質二重膜中における構造解析に関しては、現在、野生型の二量体会合面の決定には成功しており、今年度は活性型配列に関して二量体会合面の決定を行う。また、これまでの研究から膜貫通部位における特異なアミノ酸残基と脂質分子との相互作用が、当該部位の脂質二重膜中における構造安定性に寄与していることが分かってきた。固体NMRによる解析を行うことから、この相互作用に関して原子レベルで詳細を明らかとしていく。
半合成に関して、上述の通り、多くのサンプル量を必要としない蛍光測定によって、リガンド結合に伴った膜貫通―膜近傍部位の構造変化に関する知見を得る。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
試薬等は前年度から残っているものから使用したため。旅費に関しては、他の研究費、予算を用いることができたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
昨年度以前からの未使用分は、新たな試薬の購入、技術補佐員の雇用等に用いる。
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