| 研究課題/領域番号 |
24688011
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
岡田 正弘 東京大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (40377792)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | クオラムセンシング / 翻訳後修飾 / トリプトファン / イソプレニル化 / フェロモン |
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| 研究実績の概要 |
クオラムセンシングを誘導する新規クオラムセンシングフェロモンを探索するために、生合成酵素に着目したゲノムマイニングを行った。ただし、通常の相同性検索を行った場合は既知のタンパク質が数多く検出されてしまったが、申請者らが平成25年度に決定した生合成酵素ComQのモチーフ配列をフィルタリングしたところ、既知のIPPSを含まない、様々な細菌由来の300種類程度のタンパク質が検出できた。そこで次にComXフェロモンを生産する枯草菌とは別の網に属する生産細菌を候補として選定し、そのDNAを鋳型に候補タンパク質の異種発現を行った。また、選出した候補タンパク質のすぐ隣にコードされた基質ペプチド候補も同様にして異種発現を行った。これらを用いて、ファルネシル二リン酸と、Mgイオン存在下、in vitro酵素反応を行い、イソプレニル化された修飾ペプチドを合成させた。得られた反応液をファルネシル基由来のフラグメントイオンに着目したLC-MS分析を行ったところ検出に成功し、さらにMS/MS分析の結果から、C末端側から２番目のトリプトファンがファルネシル化された修飾ノナペプチドであることが判明した。
そこで、決定したアミノ酸配列および推定修飾構造を有する修飾ペプチドを化学的に合成することにした。以前の研究や、平成24年度に行った、液相合成法によるイソプレニルトリプトファンの合成を基盤に、固相ペプチド合成法を組み合わせた目的の修飾ノナペプチドの立体選択的合成を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題がおおむね順調に進展していると判断した理由は、これまで発見された、トリプトファンが翻訳後修飾によりイソプレニル化された修飾ペプチドは、申請者らが発見した枯草菌由来のComXフェロモンのみであったが、今回の研究により、枯草菌以外にも同種の修飾酵素が存在し、修飾ノナペプチドが生産されることが判明したためである。さらに、修飾ノナペプチドの化学合成を行うことが出来たためである。
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| 今後の研究の推進方策 |
今回発見した修飾ノナペプチドが、クオラムセンシングフェロモンとして機能するのであれば、例えばバイオフィルムの形成などの形態変化を数nMの濃度で示すはずである。さらに、候補タンパク質もしくは基質ペプチドの遺伝子破壊株を作製すれば、形態変化との相関が明らかになる。さらに、合成した修飾ノナペプチドの投与により変異株の形態変化が回復することが証明する。しかしながら、内生の修飾ペプチドの影響などにより表現系の変化が判断しづらい場合や、遺伝子破壊株の作製が困難な場合が考えられるため、関連遺伝子の発現解析を行い、最終的に修飾デカペプチドが特定の遺伝子発現を制御するクオラムセンシングフェロモンであることを証明する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の予想に反し、ペプチドフェロモンが複数の生命現象を誘導する生理活性物質である可能性が示された。研究遂行上、活性試験の追加実施を行い、生理活性について明らかにする必要が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
活性試験の追加実施に必要不可欠な各種試薬などの消耗品を購入して使用する計画である。
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