| 研究課題/領域番号 |
24700394
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
今野 歩 群馬大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40509048)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 小脳 / ウイルスベクター |
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| 研究概要 |
１．抗体提示型レンチウイルスベクターの最適化
通常のレンチウイルスベクターにおいて、エンベロープタンパク質として用いるVSV-Gのプラスミドを、ProteinAの抗体結合ドメインをエンベロープとして持つプラスミドに変え、抗体提示型レンチウイルスベクターの作成した。超遠心による培地上清からの回収後、PBSに懸濁して実際にマウスの小脳へ感染を行ったところ、抗体を結合させていない場合の非特異的な感染がほとんどなくなっていた。研究計画では、「E2タンパク質のウイルス表面に出ている部分を段階的に欠損させることにより、非特異的な感染性を除去する。」としていたが、これまで設備的な事情により実施不能だった超遠心による精製を加えることにより、非特異的な感染を十分に除去することができた。今後、２４年度に購入した液体クロマトグラフィーを利用した精製を加えることにより、さらなる感染の効率化を目指す予定である。
２．抗体の作成
VGluT1とVGluT2のルーメン側の抗体を受託合成により行った。それぞれRGGHVVVQKAQFN (VGluT1)、RGGKVIKEKAKFN（VGluT2）をペプチド抗原とした。抗体価は順調に上昇し、予定通りの納期で抗体が完成した。作成した抗体を用いて、マウス小脳に対する免疫組織染色を行った。ポジティブコントロールとして、市販されている抗体（ルーメン側に結合する抗体ではないため、抗体を介した感染に用いることが不可能）との共局在性が期待したものとは、異なっていた。今後、抗原として用いたペプチドのアフィニティカラムを用いた精製を行い、本手法への適応を検討する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
液体クロマトグラフィーの納入が予定よりも遅くなり、抗体提示型ウイルスベクターの精製法を検討することができなかった。しかしながら、簡便な精製方法のみで、予想していたよりも非特異的な感染が低く抑えられたことから、非特異的な感染の除去に関しては順調に研究が進んでいる。また、抗体に関しては作成は完了したが、本手法に適応するための精製ができていない状況である。
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| 今後の研究の推進方策 |
液体クロマトグラフィーを用いたウイルスベクターの精製法を確立する。必要な物品は購入済であり、今後条件検討などを行っていく。具体的には、HiTrapQ HPもしくはHiPrep Q FFを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製を予定している。
平行してウイルスベクターへ結合させるVGLUT1およびVGluT2抗体の精製も行う。抗原として用いたそれぞれのペプチドによるアフィニティー精製を介して、それぞれに対して特異的に吸着する抗体のみを調製する。
さらに精製した抗体を提示させたウイルスベクターを小脳へ感染させることにより、平行線維（顆粒細胞）あるいは登上線維（下オリーブ核ニューロン）への選択的な遺伝子導入を確認する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
主に消耗品を購入するために使用する。また、成果報告のための旅費にも利用する予定である。設備品の購入の予定はない。
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