研究課題
①新型三次元多光子レーザー顕微鏡を用いたカルシウム測定法を確立した。新型多光子レーザー顕微鏡を用いて、マウス一次体性感覚野皮質（後肢）の600 μmの深さ（皮質５層）からカルシウムイメージングを行った。ピエゾ素子を用いて対物レンズを２０Hzで上下に数百マイクロメートル振動させ、樹状突起の複数の場所からカルシウムイメージングを行った。②単一神経細胞樹状突起からのカルシウムイメージング法を確立した。生きているマウスから、ホールセル記録法を行い単一神経細胞にカルシウム色素を充填し、樹状突起のカルシウム変化と細胞体の膜電位変化を同時測定した。また、カルシウムプローブを遺伝的に発現している遺伝子改変マウス（G-CaMPマウス）を用いて樹状突起のカルシウム変化の測定法も確立した。③これらの方法を用いて、マウス後肢感覚刺激、および皮質電気刺激により誘起された樹状突起のカルシウム変化を観察し、皮質間の情報がどのように樹状突起に入力されているかを明らかにした。さらに、膜電位感受性色素を用いた皮質の膜電位イメージング法、神経トレーサーを用いた形態観察法、および細胞外電位記録法を用いて、皮質間の情報連絡のメカニズムを明らかにした。④予備研究の段階ではあるが、生きた動物の脳でカルシウムウエーブと思われる現象を観察した。今後はこの現象のメカニズムや生理的意義の解明を行う。⑤2012年度には、日本神経科学学会、北米神経科学学会、日本生理学会にて上記内容のポスター発表を行った。
2: おおむね順調に進展している
「目的１．新規三次元多光子レーザー顕微鏡を用いたCa2+測定法の確立」 本目的を達成することができた。理由を以下に述べる。対物レンズを数百マイクロメートルの範囲で最大20Hzの頻度で上下させ、広範囲の単一神経細胞の樹状突起からCa2+応答を数十ミリ秒の時間分解能で観察できるようになった。この手法によりCa2+ウエーブが樹状突起を伝播する様子が観察できるようになった。「目的２．生きた動物でもCa2+ウエーブが神経細胞で観察されるか。」 本目的を一部達成することができた。予備実験の段階ではあるが、生きた動物でCa2+ウエーブと考えられる現象を観察することができた。「目的３．Ca2+ウエーブの生理的意義の解明」 本目的は未達成である。
①「生きた動物で観察されたCa2+ウエーブのメカニズムの解明」 目的：予備実験で観察されたCa2+ウエーブのメカニズムを確立した手法を用いて明らかにする。方法：Ca2+ウェーブを特定するために、Ca2+応答の時空間的特徴（刺激からの潜時の長さや、どの程度局所的にCa2+応答が誘起されるか）を観察する。Ca2+ウェーブはIP3受容体を介したCa2+放出によって誘起されるので、IP3受容体の阻害剤を用いる。②「Ca2+ウェーブの生理的意義の解明」 目的：脳スライスを用いた研究により、Ca2+ウエーブは、シナプス可塑性を誘起することが報告されている。これよりマウスの学習とCa2+ウエーブに相関があるか検討する。方法：覚醒下のマウスにGo/No-go課題として後肢体性感覚による刺激弁別課題ができるよう訓練させる。課題遂行中のマウスの行動と樹状突起の活動の相関を検討する。課題に慣れていない（初心者）時期と、課題に十分に慣れた（経験者）時期とで、樹状突起のCa2+応答パターンに違いがないか、Ca2+ウエーブと相関がないかを検討する。相関がある場合、そのメカニズムを薬理学的手法を用いて検討する。
該当なし
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