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生体の凍結保存を成功させる為には、細胞内外における氷結晶の生成および成長の制御が重要となる。申請者はこれらを実現すべく、1.凍結保護剤で浸漬処理を行った生体をシリコンオイル中に懸濁して凍結する方法（懸濁凍結法）、2.先の縣濁物または細胞が含まれた凍結保護水溶液の液滴を連続して液体窒素中に滴下する（微小液滴凍結法）を新たな凍結処理法として着想するに至った。本手法を用いる事で保存対象物のガラス化、過冷却の低下と維持、過度な凍結濃縮の抑制など、多数の利点が期待される。昨年度は生体を微小な液滴状態で凍結可能とする装置を試作し、これを用いて保存対象物を損傷させること無く射出、凍結するまでに至っている。しかしながら、解凍後に生存した個体は得られてはいなかった。そこで本年度はこの理由を検証すべく、試料の設置から観察に至るまで液体窒素温度の維持が可能な専用冷却ステージを試作し、これを用いて粒子の結晶および非晶状態を顕微ラマンにて観察した。結果、氷に由来するピークが見られなくなるのは、エチレングリコールであれば4.0 mol/L以上、スクロース水溶液であれば1.0mol/L以上であり、何れも粒子の直径はφ100μm未満からとなった。よって、本装置で射出可能な最小粒径および害とならない凍結保護水溶液の濃度を考慮すれば、何れの粒子も非晶状態となっていない事が生存個体を得られない主な要因と考えられた。今後は伝熱を促進すべく100μm未満の生体を対象とし、更に微小な液滴とする事で本凍結装置の有効性を検証する。
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