| 研究課題/領域番号 |
24700767
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
伊藤 智広 近畿大学, 農学部, 講師 (30435854)
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| キーワード | microRNA / メカニカルストレス / 骨芽細胞 / 骨細胞 / 分化 |
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| 研究概要 |
混合ガス（95％空気-5％CO2)を用いた加圧メカニカルシステムで培養条件を検討したところ、2 MPa、24時間の加圧条件では、マウス前駆骨芽細胞（MC3T3-E1細胞）およびマウス骨細胞（MLO-Y4細胞）ともにスキャホールドから離脱し、死滅した。いくつかの培養条件を設定し、1.5 MPa、1時間の加圧メカニカルストレスを負荷する条件を決定した。このメカニカルストレス負荷条件で、MC3T3-E1細胞は分化の指標となるアルカリフォスファターゼの活性が上昇しており、骨芽細胞への分化シグナルのスイッチが入っていることを確認した。
設定した1.5 MPa、1時間の加圧メカニカルストレスをMC3T3-E1細胞またはMLO-Y4細胞付着スキャホールドに与え、トータルRNAを回収し、メカニカルストレス負荷未処理細胞から回収したトータルRNAとともにmiRNAアレイ解析に供した。その結果、メカニカルストレス負荷前と負荷後に変動するmiRNAをいくつか同定した。変動の大きいmiRNAの標的遺伝子をTargetScan6.2およびmiRandaのデータベースにより解析を行い、候補遺伝子を列挙した。また、変動したmiRNAに対するprecursor miRNAまたはantisense inhibitor処理は、加圧メカニカルストレス負荷によるMC3T3-E1細胞の分化を抑制することも確認した。MLO-Y4細胞については現在、スクレロスチンのmRNA発現を指標に変動したmiRNAの中から同定を進めている。(変動したmiRNAおよびその標的遺伝子名については特許出願検討のため、本報告書では明記せず）
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度、スキャホールドや加圧システムのコンタミネーション(水圧式メカニカルストレス）などで実験の進捗が予定より遅れたが、本年度は迅速なアレイ解析や機能発現確認が行えたため、この遅れをカバーできるところまでに至った。
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| 今後の研究の推進方策 |
アレイ解析の結果、変動したmiRNAを両細胞でいくつか確認した。しかし、すべてを期間中に機能解析することは不可能であるため、メカニカルストレス負荷により高変動したmiRNAに絞って機能解析を進めていく。さらには、その中でも分化制御メカニズム解析について進展できる可能性のあるmiRNAについて作業を集約していく。
以下、次年度の研究取り組みを示す。
１）変動miRNAの標的分子の同定
検証miRNAが結合する標的遺伝子の結合領域に変異を導入したセンサーベクターを作製し、Luciferase reporter assayにより検証する。
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