ヒト小児神経芽腫の病態に類似する新たな神経芽腫マウスモデルの解析

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24700957
• 研究機関: 千葉県がんセンター(研究所)
• 研究代表者: 末永 雄介 千葉県がんセンター(研究所), がん治療開発グループ, 研究員 (80581793)
• キーワード: N-CYM / MYCN / p63 / Neuroblastoma / De novo gene birth / cis-antisense gene / De novo evolved protein / transgenic mouse

研究概要

我々はこれまでにがん遺伝子MYCNのアンチセンス遺伝子であるN-CYMがタンパク質をコードし、神経芽腫悪性化に関わることを示してきた。昨年度はMYCN/N-CYM double Tgマウスを作成し、従来のマウスモデルであるMYCN tgマウスに比べ有意に遠隔転移率が上昇することを示した。本年度は、N-CYMによる転移促進の分子メカニズムを調べることを目的とした。
これまでの研究から、ヒト神経芽腫細胞株において、N-CYMがMYCNタンパク質を安定化すること、MYCNの安定性を制御するGSK3betaがN-CYMと結合することが示されていた。そこで、MYCN/N-CYM tgマウスの神経芽腫組織を用い、N-CYMとGSK3betaの結合を免疫沈降法で検討したところ、N-CYMと内在性GSK3betaは結合した。また、MYCNタンパク質の安定化にともなって、GSK3beta S9のリン酸化が上昇し、不活性化されていることが示された。さらに、GSK3 betaの上流制御因子であるS6Kのリン酸化がGSK3beta　S9のリン酸化と相関し、mTOR-S6K経路の活性化がGSK3betaの不活性化を介して、MYCNを安定化することが示唆された。また、MYCN tgマウスに比べMYCN/N-CYM tgマウス由来の腫瘍はCleaved Caspase-9陽性細胞が少く、アポトーシスが阻害されていた。これらの結果から、N-CYMはGSK3betaを阻害することでMYCNを安定化するとともに、mTOR-S6K経路を活性化することによりアポトーシスを阻害し、転移促進に寄与する可能性が示された。本研究の成果はPLOS GENETICS誌に受理され、掲載された。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

N-CYMによる転移促進の分子メカニズムの一端を明らかにし、論文掲載に至ったため。

今後の研究の推進方策

N-CYMによるMYCNタンパク質安定化機構を検討する実験において、予期せず、NCYMがMYC-nickの産生を促進することを見いだした。MYC-nickはMYCNおよびc-MYCがcalpainにより切断されることで産生され、大腸がんにおいてがんの悪性化に寄与することが示されている。そこで、次年度はMYC-nick産生におけるN-CYMの役割について調べる目的で、分子生物学的な研究を行う。
I. N-CYMがMYC-nick産生を直接的に促進するかを検証するため、精製タンパク質を用いたin vitro cleavage assayを行う。
II. N-CYMによるMYC-nick産生の意義を検討するため、神経芽腫細胞株を同調させ、細胞周期ごとにN-CYMおよびMYC-nickの発現量を調べる。
III. MYCN/NCYM TgマウスにおけるMYC-nick発現量をWestern blotting法により検討する。

次年度の研究費の使用計画

年度末に試薬（抗体）を購入する必要性が生じたが、残額では足りなかったため、次年度に使用することにした。
次年度使用額は当該抗体購入の費用とする予定である。

研究成果

• [雑誌論文] NCYM, a Cis-Antisense Gene of MYCN, Encodes a De Novo Evolved Protein that Inhibits GSK3-β resulting in the Stabilization of MYCN in Human Neuroblastomas (2014)
  • 著者名/発表者名: Yusuke Suenaga, S.M. Rafiqul Islam, Jennifer Alagu, Yoshiki Kaneko, Mamoru Kato, Yukichi Tanaka, Hidetada Kawana, Shamim Hossain, Daisuke Matsumoto, Mami Yamamoto, Wataru Shoji, Makiko Itami, Tatsuhiro Shibata, Yohko Nakamura, Miki Ohira, Seiki Haraguchi, Atsushi Takatori, and Akira Nakagawara
  • 雑誌名: PLOS GENETICS 巻: 10 ページ: e1003996
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1003996
  • 査読あり
• [学会発表] NCYM, a Cis-Antisense Gene of MYCN, is a De Novo Evolved Gene (2014)
  • 著者名/発表者名: Yusuke Suenaga, Mamoru Kato, Tatsuhiro Shibata, and Akira Nakagawara
  • 学会等名: ADVANCES IN NEUROBLASTOMA RESEARCH 2014
  • 発表場所: ケルン
  • 年月日: 20140512-20140516
• [学会発表] NCYM Promotes Production of Myc-nick of MYCN in Neuroblastoma (2014)
  • 著者名/発表者名: Wataru Shoji, Yusuke Suenaga, S. M. Rafiqul Islam, Masaki Nio, Akira Nakagawara
  • 学会等名: ADVANCES IN NEUROBLASTOMA RESEARCH 2014
  • 発表場所: ケルン
  • 年月日: 20140512-20140516
• [学会発表] NCYM Maintains Stemness via the Induction of OCT4 Expression in Neuroblastoma (2014)
  • 著者名/発表者名: Yoshiki Kaneko, Yusuke Suenaga, S. M. Rafiqul Islam, Daisuke Matsumoto, Yohko Nakamura, Miki Ohira and Akira Nakagawara
  • 学会等名: ADVANCES IN NEUROBLASTOMA RESEARCH 2014
  • 発表場所: ケルン
  • 年月日: 20140512-20140516
• [学会発表] NCYM induces OCT4 via stabilization of MYCN in neuroblastoma (2013)
  • 著者名/発表者名: Yoshiki Kaneko, Yusuke Suenaga, S. M. Rafiqul Islam, Daisuke Matsumoto, Yohko Nakamura, Miki Ohira, Akira Nakagawara
  • 学会等名: 第72回日本癌学会学術総会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 20131003-20131005
• [学会発表] NCYM induces OCT4 via the stabilization of MYCN in human neuroblastoma (2013)
  • 著者名/発表者名: Yoshiki Kaneko, Yusuke Suenaga, S. M. Rafiqul Islam, Daisuke Matsumoto, Yohko Nakamura, Miki Ohira, Akira Nakagawara
  • 学会等名: 平成25年度 がん若手研究者ワークショップ
  • 発表場所: 蓼科
  • 年月日: 20130904-20130907
• [学会発表] NCYM, a cis-antisense gene of MYCN, is a TAp63 target gene that encode a de novo evolved protein stabilizing MYCN in human neuroblastoma
  • 著者名/発表者名: Yusuke Suenaga, S.M. Rafiqul Islam, Jennifer Alagu, Mamoru Kato, Yukichi Tanaka, Hidetada Kawana, Shamim Hossain, Daisuke Matsumoto, Mami Yamomoto, Wataru Shoji, Makiko Itami, Tatsuhiro Shibata, Yohko Nakamura, Miki Ohira, Seiki Haraguchi, Atsushi Takatori and Akira Nakagawara
  • 学会等名: 6th p63/p73 International Workshop
  • 発表場所: 木更津
• [備考] 千葉県がんセンター研究所 ホームページ
  • URL: http://www.pref.chiba.lg.jp/gan/kenkyujo/index.html