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2012 年度 実施状況報告書

TCTPを介した神経線維腫症1型腫瘍の発症機序の解明と治療戦略の構築

研究課題

研究課題/領域番号 24700981
研究機関熊本大学

研究代表者

小林 大樹  熊本大学, 生命科学研究部, 研究員 (20448517)

研究期間 (年度) 2012-04-01 – 2014-03-31
キーワード神経線維腫 / NF1 / Neurofibromin / TCTP / プロテオミクス
研究概要

神経線維腫症1型(NF1)の原因遺伝子産物Neurofibrominの関わる病態発現機構解明を目的として、NF1発現抑制によるNF1病態モデル細胞を構築し、細胞内異常発現変動分子群を融合プロテオミクスにより網羅的に解析した。約3300種の細胞内発現分子内、NF1発現抑制により、PC12内で特異的に発現が変動する112種の蛋白質を確認した。これらには細胞運動および細胞死調節、細胞分化関連因子群に加えて、新規の腫瘍関連ネットワーク分子の上昇、特にmTOR経路調節因子であるTCTP等が含まれており、これらが総合的に細胞分化異常に関連すると考えられた。NF1発現に連動する新規分子TCTPを中心とした分子ネットワークに注目し、その詳細な機能について検証した。その結果、PDGF等の成長因子の刺激は、MAPKやPI3K-AKTシグナルを介して顕著にTCTPの発現を亢進したことを見出した。NF1腫瘍患者組織におけるTCTPの発現は、NF1腫瘍の悪性度に相関し、特に悪性末梢神経鞘腫(MPNST)においては顕著であった。NF1腫瘍細胞の生存能はTCTP過剰発現によって促進し、発現抑制により細胞サイズの縮小をともなう抑制効果をもたらした。さらに、TCTPの発現抑制および過剰発現によって、NF1腫瘍細胞の生存能およびmTOR経路の活性が有意に減少および上昇することを見出した。以上の結果から、融合プロテオミクス法により新規NF1腫瘍関連分子として同定されたTCTPは、NF1腫瘍形成と悪性化に機能的に関わっている可能性から、新規病態マーカーおよび治療標的としての有用性が示唆された。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

各種NF1遺伝子欠損培養細胞を作製して、NF1遺伝子欠損細胞内におけるTCTPの、発現上昇機構および機能の一旦を解明しており、さらにNF1腫瘍におけるTCTPの発現が腫瘍の悪性度と相関して上昇することを免疫組織化学により明らかしてきた。それら研究結果について、国内外の学会で報告しており、現在論文投稿準備中であることから、当初の計画に沿って順調に本研究が順調に進展していると評価できる。

今後の研究の推進方策

神経線維腫におけるTCTPの機能を詳細に解析し、神経線維腫モデル内のTCTPの機能阻害方法を検証することによって、神経線維腫の発症機序および治療方法のさらなる検討を行う。
1. TCTP蛋白質と結合する蛋白質の同定とその細胞内結合活性・相互作用様式を解析する。NF1病態組織・細胞抽出蛋白質からTCTP特異的に結合する蛋白質を抽出し、nanoLC-MS/MSによってこれら分子群を網羅的に単離・同定する。In-silico機能解析やネットワーク解析によって、NF1腫瘍形成に重要な役割をもつと予想される機能分子群を絞り込み、TCTPとの結合様式の生化学的に解析する。各TCTP分子結合蛋白質群の抗体を調製し、種々の培養細胞と抗体を用いて、それぞれの抗結合蛋白質抗体と抗TCTP抗体による両者の免疫沈降法によって結合を検証する。両者のTag-融合蛋白を用いて生化学的に解析し、お互いの結合のカイネティックスを解析することにより細胞内における両者の結合強度、および様々な成長因子や刺激因子を導入したときの細胞内での結合活性の変化を測定する。また、TCTPおよび結合蛋白分子の各種deletion mutantを作成し、結合活性を比較し、各結合蛋白質上の結合部位を決定する。さらに、TCTP蛋白質の翻訳後修飾部位に対する結合活性の変化を測定する。
2.NF1モデルマウス腫瘍におけるTCTP機能阻害が細胞増殖などに及ぼす効果を検討する。TCTPおよびTCTPと特異的に結合するNF1病態関連分子群のNF1治療標的として有用性を評価するため、神経線維腫モデルマウスの腫瘍内においてsiRNA/shRNA/RNAi法や低分子化合物などによって分子機能を阻害し、細胞増殖・腫瘍形成能等に及ぼす効果を検討する。これらの結果に基づき、最適なNF1腫瘍治療方法および治療標的分子を検討する。

次年度の研究費の使用計画

プロテオミクス解析における質量分析に関する分析用のカラムや試薬、生化学的実験に関する抗体、siRNA/shRNA、哺乳類発現ベクター、その他分析用試薬、動物レベルでの検証実験に関する実験用動物、細胞培養用試薬・血清、プラスチック器具類、研究調査・成果発表旅費、および研究成果論文投稿費に全額使用予定である。

  • 研究成果

    (15件)

すべて 2013 2012

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (11件) 産業財産権 (2件) (うち外国 1件)

  • [雑誌論文] Integrated proteomics identified a novel activation network of Dynein IC2-GR-COX-1 in  NF1 disease model cells2013

    • 著者名/発表者名
      Hirayama M, Kobayashi D, Mizuguchi S, Morikawa T, Nagayama N, Yoshizawa AC, Kawano S, and Araki N
    • 雑誌名

      Molecular & Cellular Proteomics

      巻: - ページ: in press

    • DOI

      10.1074/mcp.M112.024802

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Glioma initiaing cells form a differentiation niche via the induction of extra cellular matrices and integrin alpha V2013

    • 著者名/発表者名
      Niibori-Nambu A, Midorikawa U, Mizuguchi S, Hide T, Nagai M, Komohara Y, Nagayama M, Hirayama M, Kobayashi D, Tsubota N, Takezaki T, Makino K, Nakamura H, Takeya M, Kuratsu J and Araki N
    • 雑誌名

      PLOS ONE

      巻: - ページ: in press

    • 査読あり
  • [学会発表] 融合プロテオミクスによる新規神経線維腫症1型(NF1)関連因子TCTPの同定と、そのNF1腫瘍における機能解析2012

    • 著者名/発表者名
      小林大樹、平山未央、菰原義弘、水口惣平、ウィルソン-森藤政代、尹浩信、竹屋元裕、倉持朗、荒木令江
    • 学会等名
      第84回日本生化学会大会
    • 発表場所
      福岡・福岡国際会議場・マリンメッセ福岡
    • 年月日
      20121214-20121216
  • [学会発表] 腫瘍細胞内ビメンチンの翻訳後就職およびフラグメント化とその機能解析2012

    • 著者名/発表者名
      山口浩、小林大樹、荒木令江
    • 学会等名
      第84回日本生化学会大会
    • 発表場所
      福岡・福岡国際会議場・マリンメッセ福岡
    • 年月日
      20121214-20121216
  • [学会発表] 融合プロテオミクスによるグリオーマ幹細胞の分化誘導ニッチの解析2012

    • 著者名/発表者名
      荒木令江、南部(新堀)晶子、緑川宇一、永井美奈子、小林大樹、水口惣平、秀拓一郎、中村英夫、菰原義弘、竹屋元裕、倉津純一
    • 学会等名
      第84回日本生化学会大会
    • 発表場所
      福岡・福岡国際会議場・マリンメッセ福岡
    • 年月日
      20121214-20121216
  • [学会発表] 全自動2次元電気泳道装置を用いた腫瘍マーカータンパク質の解析2012

    • 著者名/発表者名
      西村宗徳、緑川宇一、長山慈、小林大樹、平山未央、廣田由夏、村上洋嗣、和田孝浩、今村隆寿、直江秀昭、佐々木裕、鵜沼豊、荒木令江
    • 学会等名
      第84回日本生化学会大会
    • 発表場所
      福岡・福岡国際会議場・マリンメッセ福岡
    • 年月日
      20121214-20121216
  • [学会発表] 融合プロテオミクスによるグリオーマの化学治療予後予測分子ネットワークの解析2012

    • 著者名/発表者名
      荒木令江、水口惣平、森川崇、坪田誠之、小林大樹、平山未央、緑川宇一、中村英夫、倉津純一
    • 学会等名
      第70回日本癌学会学術総会
    • 発表場所
      札幌・ホテルロイトン札幌
    • 年月日
      20120919-20120921
  • [学会発表] ヒト舌癌におけるHIF-1αを介した高転移性がん細胞の増殖機構の解析2012

    • 著者名/発表者名
      森藤政代、新堀晶子、水口惣平、小林大樹、荒木令江
    • 学会等名
      第70回日本癌学会学術総会
    • 発表場所
      札幌・ホテルロイトン札幌
    • 年月日
      20120919-20120921
  • [学会発表] Integrated Proteomics Identified Translationally Controlled Tumor Protein as a Biological Target for Neurofibroma and Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors2012

    • 著者名/発表者名
      Kobayashi D, Hirayama M, Komohara Y, Mizuguchi S, Wilson-morifuji M, Ihn h, Takeya M, Kuramochi A, Araki N.
    • 学会等名
      HUPO 11th Annual World Congress
    • 発表場所
      Hynes Convention Center, Boston, US
    • 年月日
      20120909-20120913
  • [学会発表] Analysis of abnormal cellular signals via silencing of NF1 tumor suppressor protein in neuronal cells by integrated proteomics2012

    • 著者名/発表者名
      Hirayama M, Kobayashi D, Morikawa T, Nagayama M, Mizuguchi S, Araki N.
    • 学会等名
      HUPO 11th Annual World Congress
    • 発表場所
      Hynes Convention Center, Boston, US
    • 年月日
      20120909-20120913
  • [学会発表] An integrated proteomics by iPEACH, a new application, identified novel activated signal cascades in chemotherapy resistant malignant gliomas2012

    • 著者名/発表者名
      Araki N, Mizugushi S, Morikawa T, kawano S, Yamaguchi A, Kobayashi D, Hirayama M, Midorikawa U, Nakamura H, Kuratsu J.
    • 学会等名
      HUPO 11th Annual World Congress
    • 発表場所
      Hynes Convention Center, Boston, US
    • 年月日
      20120909-20120913
  • [学会発表] 融合プロテオミクスによる新規神経線維腫症I型(NF1)関連因子TCTPの同定と、治療標的としての機能解析2012

    • 著者名/発表者名
      小林大樹、平山未央、菰原義弘、水口惣平、ウィルソン-森藤政代、尹浩信、竹屋元裕、倉持朗、荒木令江
    • 学会等名
      日本プロテオーム学会2012年大会
    • 発表場所
      東京・日本科学未来館
    • 年月日
      20120726-20120727
  • [学会発表] 融合プロテオミクスによるがん幹細胞の分化誘導メカニズムの解析2012

    • 著者名/発表者名
      荒木令江、南部(新堀)晶子、緑川宇一、水口惣平、小林大樹、平山未央、菰原義弘、秀拓一郎、竹屋元裕、倉津純一
    • 学会等名
      日本プロテオーム学会2012年大会
    • 発表場所
      東京・日本科学未来館
    • 年月日
      20120726-20120727
  • [産業財産権] 統合プロテオミクス解析用データ群の生成方法並びに同生成方法にて生成した統合プロテオミクス解析用データ群を用いる統合プロテオミクス解析方法、およびそれを用いた原因物質同定方法2013

    • 発明者名
      荒木令江, 小林大樹 他3名
    • 権利者名
      国立大学法人熊本大学
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      US2013-0023574-A1
    • 出願年月日
      2013-01-24
    • 外国
  • [産業財産権] 融合プロテオミクスによるNF1特異的タンパク質の同定方法、NF1特異的タンパク質発現抑制方法、NF1特異的タンパク質の腫瘍マーカー及び治療ターゲットとしての使用方法2012

    • 発明者名
      荒木令江, 小林大樹 他2名
    • 権利者名
      国立大学法人熊本大学
    • 産業財産権種類
      特許特開2012-213391
    • 公開番号
      特開2012-213391
    • 出願年月日
      2012-11-08

URL: 

公開日: 2014-07-24  

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