| 研究課題/領域番号 |
24701013
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
坂井 和子 近畿大学, 医学部, 助教 (20580559)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| キーワード | バイオマーカー |
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| 研究概要 |
(１) ＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子測定系のマルチプレックス化の検討: ＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子のマルチプレックス化を試みた。ＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子の９種のバリアントのマルチプレックス測定用プライマーをデザインし測定系の検証を行ったが、プライマー相互作用によりマルチプレックス化が困難であった。そのため、ＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子の主たるバリアントであるバリアント１、２、３に絞ったマルチプレックス測定系を構築した。
(２) 血清検体でのＥＭＬ４－ＡＬＫ測定条件の最適化: まず、血清からのＲＮＡ抽出条件として、ＴＲＩｚｏｌ法とカラム法を検討した結果、収量と操作安定性の観点からカラム法を選択した。血清由来ＲＮＡの逆転写反応には、組織検体で用いたＲａｎｄｏｍ Ｈｅｘａｍｅｒではなく、ＡＬＫ特異的プライマーを使用した。最終的に、血清由来ＲＮＡを鋳型としたＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子の検出には、逆転写反応用プライマーとしてＡＬＫ特異的プライマーを用い、Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲによる目的部位の増幅を行うことで検出が可能となった。
(３) 血清を用いた測定実施のための準備: ＥＭＬ４－ＡＬＫ陽性患者の血清の収集のため、試料提供機関である癌研有明病院呼吸器センターおよび測定機関である近畿大学医学部に申請、承認された研究計画に基づき、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる１２名のＥＭＬ４－ＡＬＫ陽性患者および１２名のＥＭＬ４－ＡＬＫ陰性患者の血清の収集を行った。
(４) 血清検体の測定: （２）で検討した手法を用いて、血清検体での測定を実施した結果、ＥＭＬ４－ＡＬＫ陽性患者の血清からバリアント１（１／１２）およびバリアント３ａ（１／１２）を検出した。検出されたＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子は、サブクローニングとダイレクトシークエンスにより確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度、血清由来ＲＮＡを鋳型としたＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子の検出系を確立し、実際に臨床検体を用いた測定を実施した。その結果、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより決定されたＥＭＬ４－ＡＬＫ陽性患者の患者血清からＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子を検出した。本年度の研究計画に対する目標は達成しており、概ね順調に進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
ＥＭＬ４－ＡＬＫ陽性患者の患者血清から検出されたＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子の割合は、１２例中２例と低いものであった。血清中に遊離している腫瘍由来ＲＮＡが微量かつ不安定であることが一因と考えられるため、血清からのＲＮＡ抽出法として磁性ビーズを用いた抽出ＲＮＡの収量の改善を図る。また、患者血清とペアの組織検体を用いて組織検体でのＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子検出の一致率を検討する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
ＲＮＡ抽出法の改善を図るため、磁性ビーズによる抽出法の検討を実施する。また、組織検体でのＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子の検討を行い、血清中での検出検体との比較を行う。
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