2012 年度実施状況報告書

抗がん剤によるＤＮＡ二本鎖切断の修復経路操作と細胞死誘導の解析

研究課題

研究課題/領域番号	24710061
研究種目	若手研究(B)
研究機関	金沢医科大学
研究代表者	逆井良金沢医科大学, 医学部, 助教 (10549950)
研究期間 (年度)	2012-04-01 – 2015-03-31
キーワード	DNA二本鎖切断 / 非相同末端連結 / 相同組換え
研究概要	放射線や抗がん剤によるDNA二本鎖切断修復（DSB）は、非相同末端連結（NHEJ）と相同組換え（HR）の二経路で修復される事が知られている。申請者らは53BP1の解離におけるヒストンメチル化の影響とRPAのリン酸化に注目して、DNA複製を介したDSBに対する修復経路選択と細胞死との関連を明らかにする。 53BP1の解離制御因子についてはsiRNAライブラリーを用いてヒストン脱メチル化因子に絞って探索を行う。スクリーニングためのアッセイ系および評価系の構築のため、既に53BP1をDSB部位に留める事が知られているOTUB1および53BP1の解離に関与すると考えられているBRCA1をノックダウンし、DSB誘導薬剤であるネオカルチノスタチン（NCS）で短時間処理した後の53BP1 の核内fociおよびHR経路の責任因子であるRad51の核内fociについて、経時変化を解析した。また、53BP1の集積・解離の影響のコントロールとして、53BP1自体のノックダウン細胞においても、Rad51 fociの解析を行った。OTUB1およびBRCA1ノックダウン細胞では、53BP1のfoci形成自体には影響は見られなかったが、コントロール細胞に比べ53BP1 fociの消失が遅く、DSB部位からの53BP1の解離が遅くなっていると考えられる。一方、53BP1のノックダウンでは、Rad51 fociがコントロール細胞と比べ非常に早く観察され、HRが亢進していると考えられる。これらのデータをコントロールとして用いて、脱メチル化酵素に対する検討を行う。また、RPAに関しては、N末に存在するリン酸化部位クラスターに対する変異体を作成した。これらの変異体を細胞に発現させ、NHEJ-HR経路への影響を解析する。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由ヒストン脱メチル化酵素に対する検討を行うに際し、OTUB1やBRCA1ノックダウン細胞で53BP1 fociおよびRad51 fociの形成を、放射線ミミックな薬剤NCSを用いて経時的な観察をしたが、NCSの処理条件や観察時間等の条件検討に時間を費やした。所属の異動に伴う一時的な研究の中断も、若干の遅れの原因となっている。解析条件固定後の進捗に関しては、おおむね順調である。
今後の研究の推進方策	53BP1のDSBからの解離に関して、NCSを用いた解析条件についてはほぼ検討を終えたため、ヒストン脱メチル化因子に絞って53BP1の解離に影響を及ぼすものの探索を進める。しかし、53BP1 fociの消失のみを基準とした解析では、HR経路に必要な53BP1の解離と修復終了に伴う解離との判別が難しいため、DNA損傷応答因子をLacO-LacRを用いて強制的にクロマチンにリクルートし、DNA鎖切断を伴わずに53BP1 fociを誘導する系を用いて、追加検証する予定である。また、RPAのリン酸化に関しては、作成した変異体を用いて、発現細胞におけるNHEJ-HR経路について、当初の計画通り53BP1やRad51のfoci形成、およびNHEJ因子の活性化を指標に、解析を行う。
次年度の研究費の使用計画	該当なし