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2012 年度 実施状況報告書

ナノベシクル1粒子ゼータ電位計測システムの開発とエキソソーム分析への応用

研究課題

研究課題/領域番号 24710114
研究機関東京大学

研究代表者

赤木 貴則  東京大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (80401149)

研究期間 (年度) 2012-04-01 – 2014-03-31
キーワードエキソソーム / ゼータ電位 / 乳がん / 前立腺がん / ナノバイオ
研究概要

平成24年度には、直径100 nm以下のナノベシクルの重要な物性であるゼータ電位を1粒子で計測するためのチップ型システムを開発した。ソフトリソグラフィー法によりポリジメチルシロキサン(PDMS)製の電気絶縁性に優れ、光学的ひずみのないマイクロ流体チップを作製し、非特異吸着抑制のために流路内表面をMPCポリマーでコーティングした。チップ内電気泳動しているナノ粒子にレーザを照射し、生じるレイリー散乱光を対物レンズで集光し、高感度イメージング技術により撮像することによって、全く新しいナノ粒子の電気泳動度計測を実現した。
粒径の異なるナノリポソームを作製し、本方法論を用いてそのゼータ電位を計測することによって、構築したシステムの性能を評価する実験の過程で、数十ナノメートルの粒径を有するナノリポソームのゼータ電位のバラツキが、ナノリポソームを構成する負電荷脂質分子の統計的ゆらぎに従って広い分布をもつという、ナノ世界に特有な現象を発見した。本研究結果は英文誌「Electrophoresis」に発表した。
研究計画を前倒しし、本システムを用いてエキソソームのゼータ電位分析へと応用した。乳がんと前立腺がんをモデルとして、正常細胞およびがん細胞の培養上清からエキソソームを精製し、エキソソーム及び由来細胞のゼータ電位を計測した。がん細胞とがん細胞由来のエキソソームの平均ゼータ電位は正常細胞に比べて負に大きく変化し、エキソソームと由来細胞のゼータ電位の間に強い相関関係が認められた。エキソソームの表面の電気的性状は、由来細胞表面の電気的性状の変化を反映しているものと考えられ、細胞の状態や種類がそれら細胞から放出されるエキソソームの体内での挙動、即ちエキソソームを介した細胞間コミュニケーションに影響していることを示唆するものである。本研究結果は英文誌「Jpn J Appl Phys」に受理された。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

ナノベシクルのゼータ電位計測システムの開発、および人工ナノベシクルのゼータ電位を計測し、その課程でナノ世界特有の現象を見出した。本成果は英文誌に掲載され、当初の計画を達成した。更に、次年度で計画していたエキソソームのゼータ電位計測に着手し、エキソソームとその由来細胞のゼータ電位の関係性を明らかにした。この成果は英文誌に掲載が決定しており、当初の計画以上の進展がみられた。

今後の研究の推進方策

当該方法論のエキソソーム表面タンパク質分析への展開を目指す。エキソソーム表面には由来細胞を反映するタンパク質が存在しており、この表面タンパク質を分析することで異常細胞の有無など、診断に有用な情報の取得が期待される。従来技術として、エキソソームマーカーであるCD63抗体修飾ビーズ上に多数のエキソソームを保持した後、蛍光修飾抗体でラベルしてフローサイトメトリーで計測する手法などが提案されている(C. Lasser, J Vis Exp, 2012)。しかし、この手法では個々のエキソソームを計測しないため、不均質なエキソソームの集団を定量的に解析することは難しい。このような課題を克服しうる新たな分析手法として、チップ免疫電気泳動法を構築し、エキソソーム表面分析への応用を試みる。
ヒト乳がんMDA-MB-231(MM231)細胞をモデル細胞とし、抗ヒトCD63抗体と30分間反応させた後、マイクロキャピラリーチップに試料を導入し、電界を印加して電気泳動を行い、個々の粒子のゼータ電位を評価し、抗体との反応によるエキソソームのゼータ電位変化について調べる。
更に、本方法論を悪性乳がんの指標であるHer2タンパク質の分析へと応用する。Her2発現株であるSk-Br-3細胞由来のエキソソームに対して抗ヒトHer2抗体を用いて免疫電気泳動実験を行い、エキソソームを利用する診断法の可能性について検討する。

次年度の研究費の使用計画

電気泳動チップ作製のための材料費、細胞およびエキソソーム準備および抗体等の試薬費、学会参加のための旅費、学会参加費、論文投稿にかかる経費として使用する計画である。

  • 研究成果

    (15件)

すべて 2013 2012 その他

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (11件) 図書 (1件) 産業財産権 (1件)

  • [雑誌論文] Statistical fluctuation in zeta potential distribution of nanoliposomes measured by on-chip microcapillary electrophoresis2013

    • 著者名/発表者名
      K. Kato, M. Koido, M. Kobayashi, T. Akagi, and T. Ichiki
    • 雑誌名

      Electrophoresis

      巻: 34(8) ページ: pp.1212-1208

    • DOI

      10.1039/c0ce00405g

  • [雑誌論文] Electrokinetic evaluation of individual exosomes by on-chip microcapillary electrophoresis with laser dark-field microscopy2013

    • 著者名/発表者名
      K. Kato, M. Kobayashi, N. Hanamura, T. Akagi, N. Kosaka, T. Ochiya and T. Ichiki
    • 雑誌名

      Jpn. J. Appl. Phys. (accepted).

      巻: 52 ページ: MN12105

    • 査読あり
  • [学会発表] Immobilization and isolation of exosomes using polyethylene glycol-lipid-modified surface in a microchannel and evaluation by atomic force microscopy2012

    • 著者名/発表者名
      T. Akagi, M. Sasaki, M. Kobayashi, T. Ichiki
    • 学会等名
      16h International Conference on Miniaturized Chemical and Biochemical Analysis Systems (Micro Total Analysis Systems 2012
    • 発表場所
      沖縄コンベンションセンター、沖縄
    • 年月日
      20121029-20121101
  • [学会発表] Evaluation of electrophoretic mobility of individual exosomes by microcapillary electrophoresis with laser dark-field microscopy2012

    • 著者名/発表者名
      K. Kato, M. Kobayashi T. Akagi, N. Kosaka, T. Ochiya and T. Ichiki
    • 学会等名
      16h International Conference on Miniaturized Chemical and Biochemical Analysis Systems (Micro Total Analysis Systems 2012
    • 発表場所
      沖縄コンベンションセンター、沖縄
    • 年月日
      20121029-20121101
  • [学会発表] Analysis and manipulation of nanovesicles in a microfluidic device2012

    • 著者名/発表者名
      T. Akagi, S. Mohri, M. Sasaki, K. Kato and T. Ichiki
    • 学会等名
      2012 MRS Spring Meeting
    • 発表場所
      SanFransisco, U.S.A.
    • 年月日
      2012-04-12
  • [学会発表] On-chip electrophoresis of human promyelocytic leukemia cells during neutrophil differentiation

    • 著者名/発表者名
      T. Akagi, and T. Ichiki
    • 学会等名
      The 10th International Symposium on Electrokinetic Phenomena(ELKIN2012)
    • 発表場所
      筑波大学, 茨城
  • [学会発表] Development of zeta potential measurement system for individual nanovesicle using microcapillary electrophoresis with laser light scattering

    • 著者名/発表者名
      K. Kato, M. Kobayashi, T. Akagi, and T. Ichiki
    • 学会等名
      The 10th International Symposium on Electrokinetic Phenomena(ELKIN2012)
    • 発表場所
      筑波大学, 茨城
  • [学会発表] On-chip evaluation of zeta-potential of individual exosomes by microcapillary electrophoresis with laser dark-field microscopy

    • 著者名/発表者名
      T. Akagi, K. Kato, M. Kobayashi, N. Hanamura, T. Ichiki
    • 学会等名
      NanoBio FIRST Int. Symp. between Sweden and Japan
    • 発表場所
      東京大学、東京
  • [学会発表] マイクロ流体デバイス技術を用いたエキソソーム精製法の開発と液中AFM法による定量評価

    • 著者名/発表者名
      赤木貴則、一木隆範
    • 学会等名
      第12回東京大学生命科学シンポジウム
    • 発表場所
      東京大学、東京
  • [学会発表] マイクロキャピラリー電気泳動チップを用いたナノリポソームの電気泳動度の評価

    • 著者名/発表者名
      赤木貴則、加藤啓、小林雅、一木隆範
    • 学会等名
      医療薬学フォーラム2012
    • 発表場所
      福岡国際会議場、福岡
  • [学会発表] マイクロキャピラリー電気泳動法を用いたがん細胞由来エキソソームの電気泳動移動度評価

    • 著者名/発表者名
      加藤 啓,小林 雅,赤木貴則,小坂展慶,落谷孝広,一木隆範
    • 学会等名
      第73回応用物理学会学術講演会
    • 発表場所
      松山大学、愛媛
  • [学会発表] オンチップ電気泳動法によるエキソソーム表面免疫性の電気的検出

    • 著者名/発表者名
      赤木貴則,加藤 啓,小林 雅,花村奈未,小坂展慶,落谷孝広,一木隆範
    • 学会等名
      第73回応用物理学会学術講演会
    • 発表場所
      松山大学、愛媛
  • [学会発表] エキソソーム分離用マイクロ流体デバイスの開発

    • 著者名/発表者名
      小林 雅,加藤 啓,赤木貴則,一木隆範
    • 学会等名
      第73回応用物理学会学術講演会
    • 発表場所
      松山大学、愛媛
  • [図書] On-Chip Cell Electrophoresis and Evaluating Cellular Functions” in “Electrical Phenomena at Interfaces and Biointerfaces: Fundamentals and Applications in Nano-, Bio-, and Environmental Sciences (Ed. H. Ohshima)”2012

    • 著者名/発表者名
      T. Akagi, T. Ichiki
    • 総ページ数
      850
    • 出版者
      Wiley
  • [産業財産権] エキソソームの分析方法、エキソソーム分析装置、及び抗体-エキソソーム複合体2012

    • 発明者名
      一木隆範、赤木貴則、塩野博文
    • 権利者名
      国立大学法人東京大学、株式会社ニコン
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      2012-185666
    • 出願年月日
      2012-08-24

URL: 

公開日: 2014-07-24  

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