| 研究課題/領域番号 |
24710232
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| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
向井 崇人 独立行政法人理化学研究所, 拡張遺伝暗号システム研究チーム, 基礎科学特別研究員 (40612114)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| キーワード | バイオテクノロジー |
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| 研究概要 |
本研究の目的は、大腸菌の遺伝暗号において、アルギニンのAGGコドンを、ホモアルギニンへ再定義する事である。終止コドンの１つであるUAGコドンに加え、本研究によってAGGセンス・コドンの再定義に成功すれば、遺伝暗号表を進化させる方法論を確立したと言える。
コドンの意味を再定義するには、コドンを翻訳する因子の改変と、ゲノム中におけるコドンの使用状況を改変する必要がある。
（１） AGGコドンは2種類のtRNAによって翻訳されており、tRNAArg4は、AGAとAGGの両方を認識し、tRNAArg5はAGGだけを認識する。本研究では、T4ファージに由来するtRNAArg変異体を開発し、AGAだけを担当させることに成功した。従って、AGGは専らtRNAArg5によって翻訳されている。次に、AGGコドンをホモアルギニンとして翻訳するシステムの開発に成功した。翻訳効率はまだ改善の余地がある。
（２） 大腸菌ゲノム上から、AGGコドンを効率よく除去する技術を開発した。必須遺伝子におけるAGGコドンを別のアルギニンコドンに置換しており、後は作業を繰り返すのみである。
以上のように、当該年度の成果として、目的を達成するための基本的な技術開発を完了したことがあげられる。特に、大腸菌ゲノムを改変する技術に関しては、一般的には、ゲノム改変を繰り返す間に、望まない突然変異によって大腸菌が弱ってしまうのであるが、本技術を用いると、生育速度を保ったままゲノム置換を蓄積させる事ができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
最初の計画では、本研究前から開発されていたM1変異体を用いる予定であったが、望ましい活性を示さない事が判明した。そこで全く新しい変異体を開発する必要があった。バクテリオファージ由来の遺伝子を用いることで、遥かに性質のよい変異体を開発することができた。
次に、最初の計画では、大腸菌K-12株を用いて、必須遺伝子からAGGコドンを同義置換していく予定だったが、K-12株はこの目的にそぐわない事が判明した。そこで、B株に乗り換えた所、いくつかの技術的問題が生じた。しかし、B株における効率的な方法の開発に成功し、有用なB株を使えるようになった。
現在はまだ５つの遺伝子に関して同義置換を施した状況だが、後は作業を繰り返すのみである。というのも、K-12株を用いた網羅的なゲノム改変実験によって、同義置換を効率的に導入する為の、オリゴDNA設計の一般則を見出したからである。
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| 今後の研究の推進方策 |
（１） 当該年度に得た、tRNA遺伝子変異体の改善を行う。T4ファージのtRNAArgは、よりAGAコドンに対する特異性を上げる。AGGコドンを翻訳するtRNAPylは、翻訳効率を倍程度に改善したい。変異体ライブラリーを作製し、スクリーニングを行う。
（２） 全ての必須遺伝子からAGGコドンを除去する。現在は５つ改変したので、残り２５遺伝子を改変する。おおよそ半年かかると見積もっている。
（３） 最後に、AGGコドンに対するアルギニンの割り当てを最小限に減らし、ホモアルギニンへ再定義できるか、調べる。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
該当なし
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