研究課題
本研究では、植物液胞の新規機能の解明を目指し、特にニチニチソウを材料に、液胞に蓄積していると考えられる薬用成分、アルカロイド等の二次代謝物質の生合成に関わる酵素や基質の同定を、メタボロミクス、プロテオミクスの手法を用いて進めている。ニチニチソウが合成するテルペノイドインドールアルカロイド(TIA) は、異型細胞と呼ばれる特殊な細胞の液胞に蓄積されることが知られている。これまでの実験から、TIAは組織やオルガネラを順に移動しながら合成され、最終的に異型細胞の液胞に蓄積されていると考えられている。前年度に、蛍光セルソーター（FACS）を用いて、ニチニチソウ葉から異形細胞を精度よく単離する方法を確立したので、当該年度は、その方法を用いて、異形細胞を単離後、遺伝子発現解析を行った結果、TIA合成経路の後半で働く酵素であるD4HやPRX1が、異形細胞において高発現していることを確認した。また、一細胞質量分析法を用いて、茎の異形細胞（ほぼ液胞）の代謝産物を分析した結果、serpentineやtabersonineなど複数のTIAが存在していることが示唆された。さらに、組織におけるTIAの分布を確認するため、質量顕微鏡を用いた解析より、ニチニチソウ茎では、TIAの合成が進むに従って、表皮細胞から異形細胞へとTIAの分布が変化していることが観察された。詳細な確認がさらに必要であるが、異形細胞の単離技術と高分解能の質量分析計を用いた新技術の組み合わせにより、TIAの網羅的解析が可能となり、これまでに報告されている遺伝子発現解析によるTIA合成経路の解明に対して、組織レベル、細胞（オルガネラ）レベルでの、各TIAの局在から、TIA合成経路の新しい知見が得られつつある。
2: おおむね順調に進展している
初年度に実験材料の再検討を行う必要があったが、FACSによるニチニチソウ異形細胞の単離技術を確立したことで、当該年度は、その方法を用いて、遺伝子発現解析を行うことができた。単離異型細胞を用いた解析に取り組みつつ、一細胞質量分析法と質量顕微鏡という新技術を用いて、ニチニチソウ葉と茎の細胞レベル、組織レベルでのメタボロミクス解析を行なった。新技術ということで、実験の条件検討に時間を要しているが、異型細胞をはじめ、各細胞におけるTIAの検出が可能となり、組織レベルでのTIAの分布を確認できている。解析結果から、これまでに報告されているTIA経路に新たな知見を与える可能性もあり、今後のさらなる解析が必要であるが、おおむね順調に伸展していると考えている。
ニチニチソウ単離異型細胞を用いたトランスクリプトーム解析、メタボローム解析、プロテオーム解析と、一細胞質量分析法で検出されたTIAのリストと質量顕微鏡における組織レベルでの分布を組み合わせた解析を行なって、ニチニチソウTIA合成経路を明らかにしていく。現在のところ、TIAの同定は、質量分析計の高分解能に依存した網羅的なものであるが、注目する物質については、標品やHPLCを用いて、詳細な確認を行なっていく。
平成25年度に、ニチニチソウ葉のメタボローム解析を試みた結果、実験条件検討に時間を要し、予定していたメタボローム解析とトランスクリプトーム解析を行えなかったため、次年度使用額が生じた。ニチニチソウ葉二次代謝産物のメタボローム解析とトランスクリプトーム解析の費用に用いる予定である。
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Plant & Cell Physiology
巻: 54 (10) ページ: 1571-1584
10.1093/pcp/pct107
