2012 年度実施状況報告書

小胞体ストレス応答センサータンパク質ＰＥＲＫの活性化機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号	24710245
研究機関	東京大学
研究代表者	中村顕東京大学, 農学生命科学研究科, 特任助教 (40432356)
研究期間 (年度)	2012-04-01 – 2014-03-31
キーワード	小胞体ストレス応答
研究概要	PERKタンパク質小胞体内腔ドメイン（LD）については、N末端のシグナル配列を除去し、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質の形で発現させ、BiPタンパク質はN末端・C末端のシグナル配列とC末端側に予想される多量体形成領域を除去し、ヒスチジンタグ融合タンパク質の形で、大腸菌において大量に発現させた。 BiPタンパク質はNiカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーで高純度に精製可能であったが、PERK LDタンパク質は細胞破砕・遠心分離後の不溶性画分に回収された。発現条件や発現宿主を多数検討しても改善がみられなかったため、高圧処理による不溶性画分からの巻き戻し法の適用を検討した。PERK LDタンパク質を含む大腸菌封入体を洗浄し、凝集抑制効果のあるアルギニン、還元剤、BiPタンパク質の有無による条件下で、200 MPaの高圧処理を施したところ、アルギニンと還元剤を共に含む条件でPERK LDタンパク質の可溶化が認められた。このときBiPタンパク質の有無はPERK LDタンパク質の可溶化に影響を与えなかった。引き続き、高圧処理したPERK LDタンパク質試料をGlutathione Sepharoseカラムに吸着させ、BiPタンパク質を添加することでGST-プルダウン法により、両タンパク質の相互作用を確認した。GSTや樹脂への結合量と比較してGST-PERK LDタンパク質に対するBiPタンパク質の結合量が多かったため、GST-PERK LDタンパク質とBiPタンパク質は相互作用すると判断した。現在、PERK-BiP複合体状態での結晶化を進めている。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由 PERK LDタンパク質が大腸菌において不溶性発現であったため、組換えタンパク質の発現条件を検討した。そのため試料調製に時間を要したが、高圧巻戻し法の適用により可溶化試料を得ることができた。現在のところ、X線結晶構造解析によって構造決定が可能なデータを収集するためのタンパク質結晶が得られていないが、継続的に結晶化を行なっている。 BiPタンパク質については、高純度な精製標品の取得に成功しており、こちらも結晶化実験を継続している。
今後の研究の推進方策	昨年度と同様の試料調製を行い、PERK LD-BiPタンパク質複合体の結晶取得を目指す。また、これと並行して可溶性タンパク質を効率的に調製するための発現系の改変も行う。それぞれのタンパク質の単独での結晶化も推し進めるとともに、特にBiPタンパク質については、PERK LDタンパク質を構成する一部のペプチドとの複合体結晶の取得も目指す。これらの研究によりPERK LDタンパク質とBiPタンパク質との相互作用の構造基盤を明らかにするとともに、相互作用を抑制するような機能性分子の開発へとつなげる。
次年度の研究費の使用計画	該当なし