| 研究概要 |
本申請研究では, 細胞の維持機構の一端である「オートファジー」現象を対象とし, 生きた細胞内にて発光検出する方法を開発する.発光検出する原理として, 発光タンパク質ルシフェラーゼを用いたタンパク質再構成法を導入する. タンパク質再構成法は, 2断片に分割したルシフェラーゼが接近する際に, 再び発光活性が回復する原理であり, ルシフェラーゼ2断片をそれぞれ各種オートファジーに関するタンパク質へ連結させることで, オートファジー下におけるタンパク質間相互作用の検出を可能とする.
最終年度では, これまで開発を行ってきたルシフェラーゼプローブの改良を行った. 前年度までのプローブの発光強度は最低限の感度を満たしているものの, 細胞イメージングなどの用途にはその発光強度は不十分であった. そこで,発光強度が強く且つ安定しているNanoLucルシフェラーゼを導入した.まず, NanoLucの再構成法上での最適な切断位置を決定した. 切断位置の予測に関しては, 先行論文を参照し, アミノ酸配列の特徴, 極性から候補位置を選出して随時確認した. 最終的に決定した切断位置でNanoLucを分断し, オートファジー関連遺伝子と融合させて細胞用発現ベクターを作製した. 精製した発現ベクターをヒト培養細胞に導入したのち, その発光値を確認した. オートファジーは培地の栄養条件が劣悪になった場合誘導されることから, 血清およびアミノ酸を除いた培地に置き換えて培養を行った. その結果,前年度のプローブと比較して, 100倍以上の発光値が観測された.
さらに, オートファジー関連タンパク質に結合するドメインを利用する事で, 内在のタンパク質量を反映した発光検出法の可能性も見出した.
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