| 研究概要 |
大腸癌患者の薬物療法を適切に実施するためには、KRAS遺伝子の変異検出を簡便かつ高感度に検出できる分析システムの開発が重要である。リガーゼ検出反応（Ligase detection reaction, LDR）は、特異的に遺伝子変異を検出できる分子生物学的手法であり、通常、変異部位由来のオリゴヌクレオチド（LDR生成物）をマイクロチップ或いはキャピラリーゲル電気泳動で検出する。LDR生成物の検出にHPLCの適用が可能であれば、LDRの汎用性の向上に有利である。本年度は、ボロンドープダイヤモンド（BDD）電極を用いた電気化学検出HPLCを開発し、LDR生成物の検出へ展開することとした。
LDR生成物の電気化学検出HPLCは、カラムにモノリス型のODS、移動相にトリエチルアンモニウム酢酸とアセトニトリル（TEAAとACN）の混液、3電極式のアンペロメトリー型電解セル（作用電極はBDD電極、参照電極はAg/AgCl、対極はステンレススチール）を用いて構築した。LDR生成物の分離分析を行うためにHPLC条件の最適化を行ったところ、TEAAとACNの混合比は9:1（v/v）、印加電位は＋1.8 V vs. Ag/AgCl、流速は25 μL/min、カラム温度は5℃を選定した。
KRAS遺伝子のエクソン１のG12Vの変異に由来するLDR生成物を電気化学検出HPLCに注入してクロマトグラムを測定したところ、20 min付近にブロードなピークとして観察できた。このピーク高さは、38.4 nAであり、LDR生成物と濃度依存性を示した。従来、LDR生成物の検出に利用されるマイクロチップ電気泳動と対比したところ、本法は、検出のための蛍光標識プライマーの作製が不要、分析装置が一般的という観点から、操作性と汎用性に優れると考えられた。
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