| 研究概要 |
1．MALDI-TOF/MSによるガングリオシドの構造解析において,最適な固体マトリックスの選択および各種金属塩添加濃度を検討した結果,ガングリオシドGM3のリチウム付加分子関連イオンが検出可能であることを昨年度確認している.本年度はさらに複雑な糖鎖構造を有するGM2およびGD1aの解析においても有用な方法であることを確認した.
2．脳低温培養条件における神経幹細胞株(MEB5)のEGF枯渇によるアポトーシス抑制機構の解析を行った結果,通常条件(37℃, EGF(+))で培養したMEB5に発現している糖脂質は大部分がGD3であったが,アポトーシス誘導条件(37℃, EGF(-), 48時間培養後)ではGM3,GM1, およびGD1aなどのガングリオシド発現が上昇することを昨年度確認した.本年度は，EGF(-)条件下では，37℃と比べ，32℃において，EGF(+)条件と近似したガングリオシドおよびβ1-integrinの発現を確認したことから，膜マイクロドメインを構成するガングリオシド組成や，膜マイクロドメインに存在している因子の発現および局在が32℃，EGF(-)条件において維持されており，その結果，アポトーシスを抑制している可能性が示唆された．さらには,各条件で培養後の糖タンパク質をSDS-PAGE後のMS銀染色による染色結果から,32℃，EGF(-)条件でのみ発現が減少する糖タンパク質が複数確認された.さらに,それぞれをプロテオーム解析した結果,幾つかの糖タンパク質の候補を推定した.
3．薄層クロマトグラフィー(TLC)上で分離した糖脂質をシリカゲルごと掻き取り,クロロホルム/メタノール抽出後,1,2-ジクロロエタン洗浄を行った結果,簡便且つ迅速に固着剤由来バックグラウンドを除去可能であることが判った.
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
最適な固体マトリックスおよび各種金属塩濃度を組み合わせたMALDI-TOF/MSによる糖脂質構造解析法により, GM3のみならず, より複雑な糖鎖構造を有するガングリオシドの構造解析においても有用であることを確認した. また, 薄層クロマトグラフィー上で分離した糖脂質をシリカゲルごと搔き取り, クロロホルム/メタノール抽出後, 1,2-ジクロロエタン抽出を行うことにより, 簡便且つ迅速に夾雑物由来バックグラウンドを除去可能であることが判った. 以上のように, 糖脂質の構造解析法確立研究は着実に成果が上がりつつある.
脳低温療培養条件における神経幹細胞株(MEB5)のEGF枯渇に伴うアポトーシス抑制機構の解析結果から, EGF(-)条件下では，37℃と比べ，32℃において，EGF(+)条件と近似したガングリオシドおよびβ1-integrinの発現が確認されたことから，膜マイクロドメインを構成するガングリオシド組成や，膜マイクロドメインに存在している因子の発現および局在が32℃，EGF(-)条件において維持されており，その結果，アポトーシスを抑制している可能性が示唆されている．しかしながら，膜マイクロドメインに存在していることが知られているThy1やCD55をウェスタンブロットにより発現を確認することはできず，また，再現性の確認に時間がかかってしまっている．
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