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2012 年度 実施状況報告書

ヘムオキシゲナーゼに関わる蛋白間相互作用およびCOによるシグナル伝達機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号 24750169
研究種目

若手研究(B)

研究機関久留米大学

研究代表者

原田 二朗  久留米大学, 医学部, 講師 (10373094)

研究期間 (年度) 2012-04-01 – 2015-03-31
キーワードヘム酵素 / ヘムオキシゲナーゼ / NMR緩和分散測定 / ヘム代謝 / 国際情報交換
研究概要

ヘムオキシゲナーゼ(HO)は、シトクロムP450還元酵素(CPR)やビリベルジン還元酵素など複数のタンパク質と協同して基質ヘムを分解する酵素である。一方、HOはガス状シグナル伝達物質と目される一酸化炭素(CO)を副産物として発生する生体内で唯一の酵素でもある。本研究課題では、HOに関わる酵素群との相互作用機構、および、COによるシグナル伝達機構を明らかとすることを目的としている。また研究の一環として、新しい手法であるNMR緩和分散測定法が、タンパク質の未知機能探索に有効であることを実証していく。
HOのNMR緩和分散測定を行ったところ、基質ヘム結合時に関連して、特定の3つの領域のアミノ酸に動き(揺らぎ)が観測された。それらの領域の内の1つは、ヘム結合部位よりも離れたタンパク質分子表面に位置し、これまでHOの機能と関連付けられてこなかった。よってその領域のアミノ酸が何故ヘム結合時に揺らぐのかを調べるために、全てについてAla置換変異体を作製し、その酵素活性を測定した。その結果、それぞれの変異体において野生型HOとは異なる活性が示され、これらアミノ酸は全て酵素機能に何かしら関与していることが分かった。このことにより、NMR緩和分散測定法はタンパク質の未知機能アミノ酸を検索するのに有効であると考えられた。
上記の変異体のうち、Phe79Alaは最も低い活性を示した。この変異体を詳細に調べていくと、Phe79はHOのヘム結合制御に関わることが分かった。一方、間接的ではあるが、近傍のArg185がCPRからの電子伝達に関与することが明らかとなった。HOの電子伝達に直接関わるアミノ酸残基が調べられたのは今回が初めてとなる。Phe79と周辺のアミノ酸がヘム結合時に揺らぐことが1つのアクションとなり、電子伝達を含めた一連の酵素反応が起こるモデルを現在考察している。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度中に予定していた、NMR緩和分散測定法のタンパク質の未知機能検索ツールとしての有効性の実証については達成できたと考えている。また、HOの変異体解析から、HOとCPRとの相互作用と未知であった電子伝達系の解明においても大きく進展した。しかしながら、これらの研究成果の学術論文による報告が遅れており、その点を含めて上記の評価とした。現在、NMRの研究については論文を投稿中であり、また、相互作用・電子伝達系の解明については投稿準備中である。

今後の研究の推進方策

平成25年度からの研究方針は、まずHOとビリベルジン還元酵素(BVR)との相互作用について調べていく予定である。この研究については、「研究実績の概要」にあるAla置換変異体の1つであるLeu77Alaが適していることを既に見出しており、この変異体を中心に解析を行っていく。また、HOとCPRとの相互作用についての研究は、結合力が弱い両タンパク質間での複合体形成を中心に行う予定である。これについても、適した変異体の候補をすでに見つけており、HO-CPR複合体を調製し、立体構造解析を目指した結晶化を検討する。
HOが反応副産物として発生するCOの生理機能の解明についても着手する予定である。過去の報告により、cGMPを合成する可溶性グアニル酸シクラーゼ(sGC)が、ある一定のCOの存在下で活性を上昇させることが報告されている。生体内で唯一COを発生する酵素であるHOがこのsGCにどの様に関わるのかを調べていく。現在のこところ、ターゲットとしたい哺乳類のsGCは、安定した調製法が未だに構築されていない。一方で、昆虫のsGCについては、大腸菌内での発現・精製法が確認されているので、この方法を参考にし、哺乳類のsGCにおいても大腸菌内での発現系の構築を行いたいと考えている。

次年度の研究費の使用計画

申請時においては、老朽化している低圧クロマトグラフィー装置(FPLC)の買換えのため、設備備品費を計上していた。しかし、当講座設置の高速液体クロマトグラフィー装置(HPLC)の一部として使用していたUV-VIS検出器が突然故障し、使用不能となったため、この検出器の代替機を優先して購入した(525千円)。HPLCは酵素活性の際の生成物の検出や酵素の精製にも用いていため、この装置なしには研究計画の遂行は不可能であった。よって、代替機の購入はやむ負えない状況での判断であったと考えている。そのため、予定していたFPLCの買換えには予算が不足し、残りの781千円を次年度に繰り越している。FPLCが老朽化していることには現在でも変わりはなく、またこの装置も研究計画遂行には欠かせない機器である。よって、次年度に繰り越した資金は、本FPLC装置が故障した場合の対応に使用する予定である。状況に応じては、次年度予算と合わせて代替機の購入も検討する。

  • 研究成果

    (34件)

すべて 2013 2012 その他

すべて 雑誌論文 (6件) (うち査読あり 5件) 学会発表 (23件) (うち招待講演 4件) 備考 (3件) 産業財産権 (2件) (うち外国 1件)

  • [雑誌論文] Specific gene bciD for C7-methyl oxidation in bacteriochlorophyll e biosynthesis of brown-colored green sulfur bacteria.2013

    • 著者名/発表者名
      J. Harada, T. Mizoguchi, S. Satoh, Y. Tsukatani, M. Yokono, M. Noguchi, A. Tanaka, and H. Tamiaki
    • 雑誌名

      PLoS ONE

      巻: 8 ページ: e60026

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0060026

    • 査読あり
  • [雑誌論文] An unexpectedly branched biosynthetic pathway for bacteriochlorophyll b capable of absorbing near-infrared light.2013

    • 著者名/発表者名
      Y. Tsukatani, H. Yamamoto, J. Harada, T. Yoshitomi, J. Nomata, M. Kasahara, T. Mizoguchi, Y. Fujita, and H. Tamiaki
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 3 ページ: 12017

    • DOI

      doi: 10.1038/srep01217

    • 査読あり
  • [雑誌論文] A variety of glycolipids in green photosynthetic bacteria.2013

    • 著者名/発表者名
      T. Mizoguchi, J. Harada, T. Yoshitomi, and H. Tamiaki
    • 雑誌名

      Photosynthesis Research

      巻: 114 ページ: 179-188

    • DOI

      doi: 10.1007/s11120-013-9802-9

    • 査読あり
  • [雑誌論文] ついに発見!幻のクロロフィル -最も効率的な光合成アンテナ系で働く光捕集色素分子-.2013

    • 著者名/発表者名
      原田二朗、民秋 均
    • 雑誌名

      月刊化学

      巻: 68 ページ: 48-53

  • [雑誌論文] A seventh bacterial chlorophyll driving a large light-harvesting antenna.2012

    • 著者名/発表者名
      J. Harada, T. Mizoguchi, Y. Tsukatani, M. Noguchi, and H. Tamiaki
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 2 ページ: 671

    • DOI

      doi: 10.1038/srep00671

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Characterization of chlorophyll pigments in the mutant lacking 8-vinyl reductase of green photosynthetic bacterium Chlorobaculum tepidum.2012

    • 著者名/発表者名
      T. Mizoguchi, J. Harada, and H. Tamiaki
    • 雑誌名

      Bioorganic & Medicinal Chemistry

      巻: 20 ページ: 6803-6810

    • 査読あり
  • [学会発表] ヘムオキシゲナーゼ分子表面で揺らぐLeu77のAla置換変異体は何故酵素活性を上昇させるのか?2013

    • 著者名/発表者名
      原田二朗、佐藤秀明、原田英里砂、東元祐一郎、杉島正一、菅瀬謙治、野口正人
    • 学会等名
      日本化学会第93回春季年会
    • 発表場所
      滋賀県・草津
    • 年月日
      20130322-20130325
  • [学会発表] 緑色硫黄細菌のバクテリオクロロフィル eのC7位のホルミル化に必須な遺伝子bciDの同定.2013

    • 著者名/発表者名
      原田二朗、溝口 正、佐藤壮一郎、塚谷祐介、横野牧生、野口正人、田中 歩、民秋 均
    • 学会等名
      第54回日本植物生理学会年会
    • 発表場所
      岡山県・岡山
    • 年月日
      20130321-20130323
  • [学会発表] クロロフィリド a還元酵素によるバクテリオクロロフィル bのエチリデン基形成.2013

    • 著者名/発表者名
      塚谷祐介、山本治樹、原田二朗、吉冨太一、溝口 正、藤田祐一、民秋 均
    • 学会等名
      第54回日本植物生理学会年会
    • 発表場所
      岡山県・岡山
    • 年月日
      20130321-20130323
  • [学会発表] ヘムオキシゲナーゼ分子表面に存在するF79の変異導入解析から見出された電子伝達機構.2012

    • 著者名/発表者名
      原田二朗、原田英里砂、東元祐一郎、杉島正一、佐藤秀明、平 順一、福山恵一、菅瀬謙治、野口正人
    • 学会等名
      第85回日本生化学会大会
    • 発表場所
      福岡県・福岡
    • 年月日
      20121214-20121216
  • [学会発表] ニトロゲナーゼ類似酵素であるクロロフィリド a還元酵素によるバクテリオクロロフィル bのエチリデン基形成.2012

    • 著者名/発表者名
      塚谷祐介、山本治樹、原田二朗、吉冨太一、溝口 正、藤田祐一、民秋 均
    • 学会等名
      第85回日本生化学会大会
    • 発表場所
      福岡県・福岡
    • 年月日
      20121214-20121216
  • [学会発表] 揺らぎが制御するヘム分解酵素反応の遠位効果.2012

    • 著者名/発表者名
      原田英里砂、杉島正一、原田二朗、野口正人、福山恵一、菅瀬謙治
    • 学会等名
      第35回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      福岡県・福岡
    • 年月日
      20121211-20121214
  • [学会発表] Genetic analysis of the green sulfur bacterium Chlorobaculum limnaeum.2012

    • 著者名/発表者名
      J. Harada, T. Mizoguchi, Y. Tsukatani, M. Noguchi, and H. Tamiaki
    • 学会等名
      Second International Symposium on Biosynthesis of Tetrapyrroles
    • 発表場所
      滋賀県・草津
    • 年月日
      20121130-20121202
    • 招待講演
  • [学会発表] Chlorophyllode a oxidoreductase, important nitrogenase-like enzymes with versatile functions.2012

    • 著者名/発表者名
      Y. Tsukatani, H. Yamamoto, J. Harada, T. Mizoguchi, Y. Fujita, and H. Tamiaki
    • 学会等名
      Second International Symposium on Biosynthesis of Tetrapyrroles
    • 発表場所
      滋賀県・草津
    • 年月日
      20121130-20121202
    • 招待講演
  • [学会発表] ヘムオキシゲナーゼの温度依存的構造変化と酵素反応に与える影響.2012

    • 著者名/発表者名
      杉島正一、原田二朗、東元 裕一郎、Keith Moffat、野口正人
    • 学会等名
      平成24年度日本結晶学会年会及び総会
    • 発表場所
      宮城県・仙台
    • 年月日
      20121024-20121026
  • [学会発表] クロロフィル色素のC17位上に結合する炭化水素鎖の生合成過程.2012

    • 著者名/発表者名
      原田二朗、溝口 正、民秋 均、大岡宏造
    • 学会等名
      日本植物学会第76回大会
    • 発表場所
      兵庫県・姫路
    • 年月日
      20120915-20120917
    • 招待講演
  • [学会発表] ヘム結合時にヘムオキシゲナーゼの分子表面で揺らぐアミノ酸残基F79の変異体解析から見出される知見.2012

    • 著者名/発表者名
      原田二朗、原田英里砂、東元祐一郎、杉島正一、佐藤秀明、平 順一、福山恵一、菅瀬謙治、野口正人
    • 学会等名
      第6回バイオ関連化学合同シンポジウム2012
    • 発表場所
      北海道・札幌
    • 年月日
      20120906-20120908
  • [学会発表] Role of structural fluctuation in enzyme catalysis of heme oxygenase 1.2012

    • 著者名/発表者名
      E. Harada, M. Sugishima, J. Harada, M. Noguchi, K. Fukuyama, and K. Sugase
    • 学会等名
      25th International conference on Magnetic resonance in biological systems
    • 発表場所
      フランス・リヨン
    • 年月日
      20120819-20120824
  • [学会発表] Characterization of the novel monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) synthase, found in green sulfur bacteria, reveals mechanisms of chlorosome biogenesis.2012

    • 著者名/発表者名
      S. Masuda, J. Harada, M. Noguchi, and H. Ohta
    • 学会等名
      14th International Symposium on Phototrophic Prokaryotes
    • 発表場所
      ポルトガル・ポルト
    • 年月日
      20120805-20120810
  • [学会発表] Studies on the reduction processes from chlorophyll a estrified with geranylgeraniol to that with Δ2,6-phytadienol in the green sulfur bacterium Chlorobaculum tepidum.2012

    • 著者名/発表者名
      H. Oh-oka, C. Azai, J. Harada, S. Miyago, T. Mizoguchi, and H. Tamiaki
    • 学会等名
      14th International Symposium on Phototrophic Prokaryotes
    • 発表場所
      ポルトガル・ポルト
    • 年月日
      20120805-20120810
  • [学会発表] 新規色素バクテリオクロロフィル fは緑色硫黄細菌の生体内でアンテナ系クロロソームを駆動する.2012

    • 著者名/発表者名
      原田二朗、溝口 正、塚谷祐介、野口正人、民秋 均
    • 学会等名
      第20回光合成の色素系と反応中心に関するセミナー
    • 発表場所
      大阪府・豊中
    • 年月日
      20120630-20120701
  • [学会発表] 緑色硫黄細菌Chlorobaculum tepidumのC8位ビニル還元酵素遺伝子変異体の色素組成から考察されるバクテリオクロロフィル生合成経路.2012

    • 著者名/発表者名
      原田二朗、溝口 正、吉冨太一、野口正人、民秋 均
    • 学会等名
      第20回光合成の色素系と反応中心に関するセミナー
    • 発表場所
      大阪府・豊中
    • 年月日
      20120630-20120701
  • [学会発表] バクテリオクロロフィルb生合成経路の解明.2012

    • 著者名/発表者名
      塚谷祐介、山本治樹、原田二朗、吉冨太一、溝口 正、藤田祐一、民秋 均
    • 学会等名
      第20回光合成の色素系と反応中心に関するセミナー
    • 発表場所
      大阪府・豊中
    • 年月日
      20120630-20120701
  • [学会発表] 種々の緑色硫黄細菌の網羅的糖脂質解析.2012

    • 著者名/発表者名
      溝口 正、原田二朗、吉冨太一、民秋 均
    • 学会等名
      第20回光合成の色素系と反応中心に関するセミナー
    • 発表場所
      大阪府・豊中
    • 年月日
      20120630-20120701
  • [学会発表] Molecular biological approach on biosynthesis of bacteriochlorophylls in phototrophic bacteria.2012

    • 著者名/発表者名
      Y. Tsukatani, J. Harada, and H. Tamiaki
    • 学会等名
      Eight International Workshop in Supramolecular Nanoscience of Chemically Programmed Pigments
    • 発表場所
      滋賀県・草津
    • 年月日
      20120622-20120624
    • 招待講演
  • [学会発表] The Structure and Function of Glycolipids in Photosynthesis.2012

    • 著者名/発表者名
      T. Mizoguchi, J. Harada, T. Yoshitomi, and H. Tamiaki
    • 学会等名
      Eight International Workshop in Supramolecular Nanoscience of Chemically Programmed Pigments
    • 発表場所
      滋賀県・草津
    • 年月日
      20120622-20120624
  • [学会発表] The role of amino acids on the surface of heme oxygenase in its catalysis: An analysis of F79A mutant.”, 7th International Congress on Heme Oxygenase and Rated Enzymes2012

    • 著者名/発表者名
      J. Harada, E. Harada, Y. Higashimoto, H. Sato, M. Sugishima, J. Taira, K. Fukuyama, K. Sugase, and M. Noguchi
    • 学会等名
      7th International Congress on Heme Oxygenase and Rated Enzymes
    • 発表場所
      イギリス・エジンバラ
    • 年月日
      20120528-20120601
  • [学会発表] Reduction of CO-bound α-verdoheme-heme oxygenase-1 complex by NADPH-cytochrome P450 reductase.2012

    • 著者名/発表者名
      H. Sato, Y. Higashimoto, H. Sakamoto, M. Sugishima, J. Harada, and M. Noguchi
    • 学会等名
      7th International Congress on Heme Oxygenase and Rated Enzymes
    • 発表場所
      イギリス・エジンバラ
    • 年月日
      20120528-20120601
  • [学会発表] NMR解析で見出されたヘムオキシゲナーゼ表面に局在するF79の機能的役割.2012

    • 著者名/発表者名
      原田二朗、原田英里砂、東元祐一郎、杉島正一、佐藤秀明、平 順一、福山恵一、菅瀬謙治、野口正人
    • 学会等名
      平成24年度日本生化学会九州支部例会
    • 発表場所
      福岡県・福岡
    • 年月日
      20120526-20120527
  • [備考] ウェブ報道, マイナビニュース

    • URL

      http://news.mynavi.jp/news/2012/09/28/151/index.html

  • [備考] ウェブ報道, 大学プレスセンター

    • URL

      http://artificial-photosynthesis.net/katsudo/media.html

  • [備考] ウェブ報道, 日経バイオテクONLINE

    • URL

      https://bio.nikkeibp.co.jp/article/news/20120928/163467/

  • [産業財産権] 緑色硫黄細菌変異体およびバクテリオクロロフィル.2013

    • 発明者名
      原田二朗、野口正人、民秋 均
    • 権利者名
      原田二朗、野口正人、民秋 均
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      PCT/JP2013/53295
    • 出願年月日
      2013-02-13
    • 外国
  • [産業財産権] 緑色硫黄細菌変異株及びそれを用いたバクテリオクロロフィルc同族体の製造方法.2012

    • 発明者名
      原田二朗、野口正人、民秋 均
    • 権利者名
      原田二朗、野口正人、民秋 均
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      特願 2012-260321
    • 出願年月日
      2012-11-28

URL: 

公開日: 2014-07-24   更新日: 2019-06-06  

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