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2012 年度 実施状況報告書

高速原子間力顕微鏡による脚の短いプロセッシブミオシンの運動メカニズムの解明

研究課題

研究課題/領域番号 24770149
研究種目

若手研究(B)

研究機関金沢大学

研究代表者

古寺 哲幸  金沢大学, バイオAFM研究センター, 准教授 (30584635)

研究期間 (年度) 2012-04-01 – 2015-03-31
キーワード1分子計測・操作 / モータータンパク質 / 原子間力顕微鏡 / ミオシン / アクチン
研究概要

ミオシン6とミオシン10は、細胞内で小胞輸送や、特定の構造を保持するためのアンカーとして機能しているモータータンパク質である。各ミオシンの脚(レバーアーム部)の長さは、細胞内で同じく小胞輸送を担うミオシン5のものと比べて、ミオシン10の場合は半分、ミオシン6にいたっては3分の1しかない。近年、これらの脚の短いミオシンでも、アクチンフィラメント上を大きな歩幅でプロセッシブ運動できることが報告され、注目を集めているが、それらの構造的証拠はほとんど得られていない。そこで、本研究では高速原子間力顕微鏡(高速AFM)を用いて、運動中のミオシン6とミオシン10の構造形態変化を直接観察することで、その構造的証拠を提出し、それぞれのミオシンの機能メカニズムを詳細に解明することに取り組んでいる。当該年度は、運動中のミオシン10の構造形態変化を詳細に観察することに主に取り組んだ。その結果、昨年までにミオシン6の運動観察で観察されたような(1)2つのモーター部を大きく広げた構造形態をとることで大きな歩幅で前進運動すること、(2)2つのモーター部が隣り合うアクチンのサブユニット上に寄り添うような形で結合する様子が直接的に観察された。以上の観察結果は、ミオシン10の運動様式を直接観察した画期的な成果である。また、AFMの画像撮影中に狙った場所にだけに力を及ぼすことができる走査モード(インタラクティブモード)を開発した。その性能を評価するために、ATP非存在下のミオシン5の後ろ足にだけ力を及ぼすことを試み、ミオシン5に人工的な一方向運動を誘起することに成功した。この結果は、ミオシン5の前進運動にATPの加水分解サイクル中の中間状態ADP.Pi状態は必要ないという極めて重要なことを示唆している。このモードは、ミオシン6やミオシン10の運動メカニズムを解明するに当たっても非常に有効である。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

本研究課題を実施することができたために、ミオシン6とミオシン10がアクチンフィラメント上を大きな歩幅で歩行運動するための構造基盤をリアルタイムに撮影できたことは特筆に値する。また、2つのミオシンがアクチンフィラメントに2つの頭部で結合しているときの前足にわずかながら回転運動が見られることに気が付いている。この回転運動はレバーアーム部位が硬いと考えられるミオシン5のときは見られないので、レバーアーム部位のフレキシビリティーが、この運動の有無を決めているということが示唆される。このような観察結果は、従来の手法では取得することができないために、これらのミオシンの運動メカニズムを別の視点からより詳細に理解することに繋がると考える。
しかしながら、これらのミオシンの構造(レバーアーム部位)は、これまでに観察に成功しているミオシン5のものと比べて小さいために、詳細に観察することが難しいという問題がある。また、運動がミオシン5のものと比べてレギュラーではないため(前進運動だけでなく後進運動もしばしば行う)、統計解析をするに当たりミオシン5のとき以上に観察例が必要である。現在、高分解能観察や統計解析に十分な観察例を集めている段階であるが、AFM探針の劣化が著しいため、当初計画していた程に観察例が集まらないという状況である。

今後の研究の推進方策

昨年度に引き続き、運動中のミオシン6とミオシン10の詳細な構造形態変化を撮影した観察例を統計解析に持ち込めるほど収集することが第一の課題である。しかしながら、現在のAFM探針は劣化が著しく、さらに、ミオシン6とミオシン10の構造(レバーアーム部位)は、これまでに観察に成功しているミオシン5のものと比べて小さいために、それらの構造を高い空間分解能で観察することができないという問題がある。この解決には、先鋭・高寿命のAFM探針の開発が課題である。そこで、新規AFM探針材料を探索することで、この課題に取り組む。電子顕微鏡内に昇華物質を入れてEBD(Electron Beam Deposition)法で探針を作ると、物質に依存した探針が得られることが知られている。この課題は非常に地味ではあるが、今後の実験効率を劇的に改良することが見込まれるので、時間をかけて取り組む。
ミオシン10に関しては細胞内ではフィロポーディア付近の束化したアクチンフィラメント上で機能していることが知られている。よって、ミオシン10に関しては、束化したアクチンフィラメント上での運動に関しても観察を行う。
当該年度に成功しているインタラクティブモードを用いた、ATP非存在下でのミオシン5の前進運動の観察結果は、当該分野に非常に大きなインパクトを与えるはずであるので、この研究課題も併せて推進する。

次年度の研究費の使用計画

高速AFM観察を行うためには、消耗品として高速微小カンチレバーが必須であるので、その購入に研究費を充てる。昨年度に引き続き、生化学試薬を購入し、本研究を実施するにあたり必須なアクチンフィラメントとミオシンの試料調整と、AFM観察に用いる基板調整を行う。また、新規AFM探針材料を模索するために、有効と思われる化学試薬を購入する。その他、顕微鏡装置の改良は、研究を効率化するために引き続き実施していくことが重要である。そのため、必要に応じて、機械部品や電子部品を製作するために研究費を使用する。また、これまでに得られている観察結果を専門家の前で発表し、意見交換を行うことは、本研究の成果を論文発表の形に持っていくための前段階として、非常に重要と考えるので、国内外の学会に参加するための旅費を計上する。

  • 研究成果

    (30件)

すべて 2013 2012 その他

すべて 雑誌論文 (5件) (うち査読あり 5件) 学会発表 (19件) (うち招待講演 12件) 図書 (2件) 備考 (4件)

  • [雑誌論文] High-speed AFM and applications to biomolecular systems2013

    • 著者名/発表者名
      T. Ando, T. Uchihashi, and N. Kodera
    • 雑誌名

      Annual Review of Biophysics

      巻: 42 ページ: 393-414

    • DOI

      doi:10.1146/annurev-biophys-083012-130324

    • 査読あり
  • [雑誌論文] hosphorylation-coupled intramolecular dynamics of unstructured regions in chromatin remodeler FACT2013

    • 著者名/発表者名
      M. Hashimoto, N. Kodera, Y. Tsunaka, M. Oda, M. Tanimoto, T. Ando, K. Morikawa and S. Tata
    • 雑誌名

      Biophysical Journal

      巻: in press ページ: in press

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Nano-Scale Alignment of Proteins on a Flexible DNA Backbone2013

    • 著者名/発表者名
      N. Nojima, H. Konno, N. Kodera, K. Seio, H. Taguchi, M. Yoshida
    • 雑誌名

      PLoS One

      巻: 7 ページ: e52534

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0052534

    • 査読あり
  • [雑誌論文] High-Speed Atomic Force Microscopy2012

    • 著者名/発表者名
      T. Ando, T. Uchihashi, and N. Kodera
    • 雑誌名

      Japanese Journal of Applied Physics

      巻: 51 ページ: 08KA02

    • DOI

      10.1143/Jjap.51.08ka02

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Guide to video recording of structure dynamics and dynamic processes of proteins by high-speed atomic force microscopy2012

    • 著者名/発表者名
      T. Uchihashi, N. Kodera, and T. Ando
    • 雑誌名

      Nature Protocols

      巻: 7 ページ: 1193-1206

    • DOI

      10.1038/nprot.2012.047

    • 査読あり
  • [学会発表] 高速原子間力顕微鏡による生体分子のナノ動態撮影2013

    • 著者名/発表者名
      古寺哲幸
    • 学会等名
      第68回日本物理学会年次大会
    • 発表場所
      広島大学・東広島キャンパス
    • 年月日
      20130326-20130329
    • 招待講演
  • [学会発表] Imaging study on intrinsically disordered proteins by high-speed atomic force microscopy2013

    • 著者名/発表者名
      N. Kodera, SK. Dora, and T. Ando
    • 学会等名
      XV. Annual Linz Winter Workshop
    • 発表場所
      Linz, Austria
    • 年月日
      20130215-20130218
    • 招待講演
  • [学会発表] Structure of proteins involved in mycoplasma mobile gliding revealed by electron microscopy and high speed atomic force microscopy (AFM)2013

    • 著者名/発表者名
      Yuhei Tahara, Noriyuki Kodera, Toshio Ando, and Makoto Miyata
    • 学会等名
      BLAST XII meeting
    • 発表場所
      Hilton Tucson East Hotel, Tucson, AZ, USA
    • 年月日
      20130120-20130125
  • [学会発表] 高速原子間力顕微鏡(高速AFM)で捉えた運動マシナリー2012

    • 著者名/発表者名
      古寺哲幸, 田原悠平, 笠井大司, 宮田真人, 相沢慎一, 安藤敏夫
    • 学会等名
      第85回日本生化学会大会
    • 発表場所
      福岡国際会議場・マリンメッセ福岡
    • 年月日
      20121214-20121216
    • 招待講演
  • [学会発表] DNA構造によるタンパク質の柔軟な連結2012

    • 著者名/発表者名
      野島達也, 紺野宏記, 古寺哲幸, 清尾康志, 田口英樹, 吉田賢右
    • 学会等名
      「細胞を創る」研究会5.0
    • 発表場所
      東京工業大学・すずかけ台キャンパス, 横浜
    • 年月日
      20121121-20121122
  • [学会発表] Imaging study on intrinsically disordered proteins by high-speed atomic force microscopy2012

    • 著者名/発表者名
      N. Kodera, SK. Dora, and T. Ando
    • 学会等名
      3rd Kanazawa Bio-AFM Workshop
    • 発表場所
      Kanazawa, Japan
    • 年月日
      20121105-20121108
    • 招待講演
  • [学会発表] 高速原子間力顕微鏡による生体分子のライブイメージング2012

    • 著者名/発表者名
      古寺哲幸, 内橋貴之, 安藤敏夫
    • 学会等名
      生理研研究会「電子顕微鏡機能イメージングの医学・生物学への応用」
    • 発表場所
      岡崎コンファレンスセンター
    • 年月日
      20121024-20121025
    • 招待講演
  • [学会発表] 高速AFMによるミオシンVの運動機構に関する研究2012

    • 著者名/発表者名
      古寺哲幸
    • 学会等名
      ナノプローブテクノロジー第167委員会 第68回研究会
    • 発表場所
      旅館清山コンベンションホール(福島県)
    • 年月日
      20121018-20121019
    • 招待講演
  • [学会発表] High-speed AFM observation of intrinsically disordered proteins (NTAIL-GFP, PNT-GFP and SIC1-GFP)2012

    • 著者名/発表者名
      Sujit Kumar Dora, Noriyuki Kodera, David Bloquel, Johnny Habchi, Antonie Gruet, Sonia Longhi, and Toshio Ando
    • 学会等名
      第50回日本生物物理学会年会
    • 発表場所
      名古屋大学・東山キャンパス, 名古屋
    • 年月日
      20120922-20120924
  • [学会発表] Structural dynamics of RecBCD enzyme during DNA degradation processes studied by high-speed atomic force microscopy2012

    • 著者名/発表者名
      Yusuke Moriguchi, Naofumi Handa, Noriyuki Kodera, and Toshio Ando
    • 学会等名
      第50回日本生物物理学会年会
    • 発表場所
      名古屋大学・東山キャンパス, 名古屋
    • 年月日
      20120922-20120924
  • [学会発表] Basic research for the development of high-speed ultrasonic AFM2012

    • 著者名/発表者名
      Yasuto Nagashima, Tomofumi Saito, Noriyuki Kodera, and Toshio Ando
    • 学会等名
      第50回日本生物物理学会年会
    • 発表場所
      名古屋大学・東山キャンパス, 名古屋
    • 年月日
      20120922-20120924
  • [学会発表] Direct observation of walking behavior of myosin X by high-speed atomic force microscopy2012

    • 著者名/発表者名
      Yusuke Sakiyama, Noriyuki Kodera, Osamu Sato, Ikebe Mitsuo, and Toshio Ando
    • 学会等名
      第50回日本生物物理学会年会
    • 発表場所
      名古屋大学・東山キャンパス, 名古屋
    • 年月日
      20120922-20120924
  • [学会発表] 高速原子間力顕微鏡による生体分子の構造ダイナミクスの観察2012

    • 著者名/発表者名
      古寺哲幸, 内橋貴之, 安藤敏夫
    • 学会等名
      高分子学会 バイオ・高分子研究会
    • 発表場所
      三谷温泉・松風園(愛知県)
    • 年月日
      20120921-20120922
    • 招待講演
  • [学会発表] Direct observation of structural dynamics of biological molecules by high-speed atomic force microscopy2012

    • 著者名/発表者名
      N. Kodera, T. Uchihashi, T. Ando
    • 学会等名
      第50回日本生物物理学会年会
    • 発表場所
      名古屋大学・東山キャンパス, 名古屋
    • 年月日
      20120920-20120920
    • 招待講演
  • [学会発表] High-speed AFM and mechanochemical coupling in walking myosin V2012

    • 著者名/発表者名
      T. Ando and N. Kodera
    • 学会等名
      UK-Japan symposium for mechanochemical cell biology
    • 発表場所
      Scarman House, Univ. of Warwick, UK
    • 年月日
      20120823-20120824
    • 招待講演
  • [学会発表] High-speed atomic force microscopy for biology2012

    • 著者名/発表者名
      T. Ando, T. Uchihashi, and N. Kodera
    • 学会等名
      International Scanning Probe Microscopy Conference
    • 発表場所
      Toronto, Canada
    • 年月日
      20120615-20120618
    • 招待講演
  • [学会発表] 高速AFMによる天然変性タンパク質の研究2012

    • 著者名/発表者名
      古寺哲幸, 安藤敏夫
    • 学会等名
      「天然変性蛋白質」第3回領域会議
    • 発表場所
      北広島クラッセホテル, 北海道
    • 年月日
      20120531-20120601
  • [学会発表] 生物試料の高速・超解像度AFM観察

    • 著者名/発表者名
      安藤敏夫, 内橋貴之, 古寺哲幸
    • 学会等名
      第93春季日本化学会年会アドバンスト・テクノロジー・プログラム 新材料開発最前線(自己組織化技術、融合マテリアルが支えるバイオミメティクス研究の最前線)
    • 発表場所
      立命館大学くさつキャンパス
    • 招待講演
  • [学会発表] 高速スキャンAFM

    • 著者名/発表者名
      古寺哲幸
    • 学会等名
      平成24年度 新学術領域研究 キックオフミーティング 運動超分子マシナリーが織りなす調和と多様性
    • 発表場所
      名古屋大学・東山キャンパス, 名古屋
    • 招待講演
  • [図書] Single-molecule Studies of Proteins2013

    • 著者名/発表者名
      T. Uchihashi, N. Kodera, and T. Ando
    • 総ページ数
      274
    • 出版者
      Springer New York
  • [図書] Atomic Force Microscopy in Liquid2012

    • 著者名/発表者名
      Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N., Shibata, M., Yamamoto, D., and Yamashita, H.
    • 総ページ数
      402
    • 出版者
      Wiley-VCH
  • [備考] 金沢大学生物物理学研究室

    • URL

      http://www.s.kanazawa-u.ac.jp/phys/biophys/index.htm

  • [備考] 金沢大学理工研究域バイオAFM先端研究センター

    • URL

      http://www.se.kanazawa-u.ac.jp/bioafm_center/index.htm

  • [備考] 金沢大学研究者情報

    • URL

      http://ridb.kanazawa-u.ac.jp/public/detail_en.php?id=3403&page=1&search=1&keyword=Kodera&andor=AND&tgt1=1&tgt2=&tgt3=&tgt4=

  • [備考] 金沢大学理工研究域テニュア・トラック教員紹介ページ

    • URL

      http://www.se.kanazawa-u.ac.jp/tenure/staff/kodera.html

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公開日: 2014-07-24  

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