| 研究課題/領域番号 |
24770194
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| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
西出 賢次 独立行政法人理化学研究所, 平野染色体ダイナミクス研究室, 基礎科学特別研究員 (70585067)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| キーワード | 染色体 / コンデンシン / 受精卵 |
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| 研究概要 |
コンデンシンは分裂期染色体の構築に中心的な役割を果たすタンパク質複合体である。多くの真核生物には、ふたつの異なるコンデンシン複合体（コンデンシンIとII）が存在し、分裂期では両者は協調しつつも異なる役割を担う。不思議なことに間期では両者の細胞内局在は劇的に異なっているが、その理由と制御メカニズムについては全く分かっていない。我々は、コンデンシン局在制御の意義とその普遍性（または特殊性）を理解する手掛かりを得るため、受精卵を用いて研究を進めている。受精卵には精子と卵子に由来するクロマチンが距離をおいて共存し、それぞれが独立して２つの前核（雄性前核と雌性前核）を形成する。こうした体細胞とは大きく異なった状況下で、コンデンシンIとIIがどのような細胞内局在を示すか、という問題は大変興味深い。
本年度は、マウス受精卵における時間軸に沿ったコンデンシンIとIIの細胞内局在変化を追跡した。まず、蛍光標識されたコンデンシンIまたはIIを受精卵で発現するトランスジェニックマウスを開発した。これらのマウスを利用することにより、受精直後から卵割までのコンデンシンIとIIそれぞれの細胞内局在変化をリアルタイムで捉えることに成功した。その結果、興味深いことに、受精直後ではコンデンシンIは雄性前核内に存在するが、細胞周期の進行と共に核外へ排出されることが明らかとなった。これに対し、コンデンシンIIは間期を通じて両方の前核内に局在し続ける。すなわち、受精直後の卵ではコンデンシンIが特徴的な動態を示すが、細胞周期の進行に伴って体細胞で観察されるような局在パターンが確立していくようだ。今後は、培養細胞系などを利用し、コンデンシンIの局在変化を制御する分子メカニズムを明らかにする予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の予定通りライブイメージングに使用可能なトランスジェニックマウスの開発に成功した。さらに、共焦点レーザー顕微鏡を使ったイメージング実験系のセットアップもほぼ終了している。したがって、生きた受精卵における動態解析は問題なく進捗していると判断した。
また、コンデンシンIの局在変化を制御する分子メカニズムの解明のためには、制御因子の最有力候補であるXPO7を検出・操作するための抗体が必要不可欠である。すでに、複数の抗原タンパク質の精製に成功し、抗体の作製も進行中である。さらに、大腸菌で発現・精製したマウスXPO7を用いて、（Ran-GTP存在下で）コンデンシンIと特異的に複合体を形成するかを検証中である。以上の結果を活かして、次年度には大きな進展が期待できると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
ふたつのコンデンシンの細胞内局在を制御するメカニズムとその生物学的意義を明らかにするために、以下の3つの研究計画を実行する。
１、 本年度に確立したトランスジェニックマウスを利用して、コンデンシンIとIIを蛍光によって同時に検出できる系を作製する。コンデンシンIとIIの異なる局在パターンが確立するまでのプロセスを可視化し、詳細に記述する。
２、哺乳類の培養細胞を利用し、ふたつのコンデンシンの細胞内局在を制御する分子メカニズムを調べる。 まず、XPO7に対する特異抗体を調整する。XPO7抗体による免疫染色および免疫沈降法により、コンデンシンIとXPO7との関係を明らかにしていく。
３、カエル卵抽出液に由来する試験管内染色体構築系を利用して、コンデンシンIの核外排出メカニズムの破綻が染色体構築にあたえる影響を調べる。XPO7抗体が得られれば、それを用いて、免疫除去実験と染色体の表現型解析を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
共同研究者が作製したトランスジェニックマウスの搬入と選別・繁殖に時間がかかったため、飼育費とマウスの実験に使用する試薬代金が予定以下となった。そのため研究費に余裕が生じ、一部を次年度に繰り越した。数を増やしたマウスの維持にコストがかかるため、次年度はマウスの飼育費に余った予算を含めた研究費を使用する。さらに生化学実験試薬、細胞培養試薬そしてプラスチック機器にも予算の一部をあてる。
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