研究課題
発現制御遺伝子は、環境変化や遺伝的な撹乱に対して抑制フィードバックとよばれる仕組みをつかい自身の発現を安定に保ちながら、組織や器官の形成を正しく行う。しなしながら、発現の低下のし過ぎや上昇のし過ぎを繰り返すと、抑制フィードバックのみでは発現が一定のレベルに収束しなくなる。胚発生はロバスト性が高いと言われており、抑制フィードバックだけでなく何らかの発現の振動をさける仕組みが存在すると推測される。しかしながら、その分子実体は未だにとらえられていない。申請者は、最近、遺伝子の発現安定化機構に、パラログ遺伝子間で保存されているエンハンサーが関与することを発見した。本研究では、これらエンハンサーの働きを胚内で可視化、定量化し、遺伝子発現の揺らぎを安定化させる仕組みの実体を解明することを目的としている。本年度は「Pax2の発現安定化におけるPax5の機能の解析」を計画しており、具体的にはパラログの一方の発現をアンチセンスモルフォリノでほぼ完全に抑制した状態で、もう一方のパラログに対するアンチセンスモルフォリノを用いて発現量を変えることで、下流遺伝子のWT1の発現動態を解析する予定であった。アンチセンスモルフォリノを用いたノックダウン法で完全には遺伝子の発現を抑制することができないが、近年、ゲノム編集技術TALENを用いることで遺伝子を破壊し、その発現を完全に抑制できる状況になっている。そこでパラログ遺伝子の発現を抑制する方法をアンチセンスモルフォリノからTALENに変更し、本年度は目的遺伝子を胚内で破壊することに成功した。
2: おおむね順調に進展している
これまでツメガエルでは目的遺伝子を完全に破壊する方法がなく、アンチセンスモルフォリノで「ほぼ完全に抑制した状態」をつくりパラログ間の相互作用の解析を進めてきた。しかしながらこのようなノックダウン法のみではパラログ遺伝子間の相互作用を解析するには十分とは言えず、完全に遺伝子の発現抑制するノックアウト法が必要であった。本年度は、急速に発展したゲノム編集技術を使うことでパラログ遺伝子の一方の発現を完全に抑制した状態をつくることに成功し、十分な進展がみられた。現在、これらパラログ遺伝子が破壊された胚をもちいて、もう一方のパラログの発現量をアンチセンスモルフォリノで低下させ、その下流遺伝子の発現動態の解析を進めている。定量解析については昨年度までに、Pax2/5のパラログ遺伝子のうち、Pax2のエンハンサーの下流にホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼを連結したツメガエルのレポータートランスジェニックを作製し、ホタルルシフェラーゼを用いたときに発光シグナルを捉えることができ、ウミシイタケルシフェラーゼを用いた場合は発光シグナルを捉えることができないことを明らかにしている。しかしながら発光を捉えることができたエンハンサーレポーター- トランスジェニックにおいても、浜松ホトニクスのImageEM C9100-13を用いた場合、10分間の露出時間が必要であった。そのため胚を長時間固定する必要があり、その後の胚発生への影響がみられた。研究計画では多色ルシフェラーゼを用いて、2つあるいは3つの遺伝子の発現ダイナミクスを、個体内で捉える計画であったが、これらルシフェラーゼ遺伝子を用いてもホタルルシフェラーゼと同様に長時間の露出時間が予想され、現在、より短い時間で発光シグナルを捉えるために、高い発光安定性をもつEmeraldルシフェラーゼをもちいたレポーターを準備している。
先に述べたように、現在、ルシフェラーゼよりも高い発光安定性をもつEmeraldルシフェラーゼをもちいたレポーターを準備中であるが、その安定性の高さ故に発現のダイナミクスを捉えることができない可能性もある。そこでリズム変動を検出するために最適化されたEmeraldルシェーラーゼ (PEST)を用いたレポーターについても同様に準備を進めている。
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