| 研究概要 |
進化過程において、真骨魚類の孵化は、単一酵素による分解系から２種の酵素による効率の良い分解系へと進化している。卵膜分解作用から、２種の酵素による分解系は、本来の酵素と同様の機能を持つ酵素（祖先型酵素）と新規機能酵素よりなることが明らかとなった。真骨魚類の中で初期に分岐したカライワシ類は単一種の孵化酵素を持ち、卵膜を膨潤させることによって孵化を行う。これが祖先型の卵膜分解メカニズムであると考えられる。一方カライワシ類より後期に分岐した正真骨類の魚種は２種類の孵化酵素clade I, clade II酵素をもち孵化時には２種の酵素により卵膜が可溶化される。２種類の酵素による分解系では各酵素が卵膜タンパク質(ZPタンパク質）の別々の部位を切断することが分かっており、２種の酵素は特異性がはっきりと分かれている。しかし、正真骨類と側系統的に分岐したもう一方のグループ、ニシン・骨鰾類の魚種はclade I, clade IIの２種類の酵素を持つにもかかわらず、卵膜を可溶化することなく膨潤により孵化が行われる。このことから、孵化酵素の進化のみではなく、ZPタンパク質の進化にも着目して研究を行った。２種類の孵化酵素をもつニシン・骨鰾類の魚種のZPタンパク質は未だクローニングされておらず、卵膜側の進化過程における変化を比較できなかったので、ニシン・骨鰾類に属する３魚種（ニシン、カタクチイワシ、ミルクフィッシュ）からzp遺伝子をクローニングし、特徴づけを行った（Sano et al, 2013）。これは孵化酵素の機能進化の研究をするうえで基質側の配列情報を得るという重要性だけでなく、これらの魚種は真骨魚類のzp遺伝子の系統関係を網羅的に知るために欠けていたグループの魚種であることから、卵膜の進化の研究にも貢献できたと考えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
魚類の卵膜分解メカニズムの変化は孵化酵素の機能の変化に加えて卵膜も酵素に対応した変化が必要なように見受けられた。ZPタンパク質はZP domainと呼ばれる保存領域と保存性の低いN末端領域で構成されている。祖先型の分解系のカライワシ類の孵化酵素はN末端領域を切断して卵膜を膨潤させ、２種類の孵化酵素(clade I, clade II)を持つ正真骨類はclade I酵素がN末端領域を切断するのに加えて、clade II酵素がZP domain内(mid-ZPd site)とZP domainの上流(N-ZPd site)を切断することで卵膜を可溶化させる。しかし、ZPタンパク質のアミノ酸配列を比較すると、clade II酵素に切断される部位は正真骨類の魚種間では保存されているのに対してカライワシ類では保存されていない。そこで、昨年度は２種類の酵素を持つにもかかわらず卵膜を可溶化しないニシン・骨鰾類の魚種からZP遺伝子をクローニングし特徴づけを行った。その結果、mid-ZPd siteが祖先型の配列に近いこと、つまり、切断点配列が保存されていることがわかった。これは、進化過程で２種類の酵素を獲得したにもかかわらず、基質の配列変化が同期して起きなかったことで、可溶化という卵膜分解系を得られなかったのではないかと予想された。
リコンビナント孵化酵素は、当研究室ですでに複数種の孵化酵素を作製して実験に用いており、作製のノウハウは確立している。孵化酵素によってリフォールディングの効率の良し悪しは様々であり、また変異を入れることでその効率が低下することも見られる。そこで、どの魚種の孵化酵素を用いて変異入りのリコンビナント酵素を作製するのが適当かを検討するために、clade I, clade IIをもつ正真骨類の魚種から、メダカ、ウミメダカ、サンマの孵化酵素のリフォールディングを行った。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
1.リコンビナント酵素作製
（Quiagen Ni-NTA, GE SOURCE 15S, 64,900円、SP Sepharose High Performance, 29,500円など）
2.クローニング用品
（SMART RACE cDNA Amplification Kit, 168,000円、EX-Taq, 88,000円、DNAシーケンサー試薬 Big Dye, 123,500円など）
3.タンパク質配列決定
（プロテインシーケンサー試薬類）
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