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2012 年度 実施状況報告書

2つの新規な糖質ホスホリラーゼの分子解析

研究課題

研究課題/領域番号 24780091
研究機関北海道大学

研究代表者

佐分利 亘  北海道大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (00598089)

研究期間 (年度) 2012-04-01 – 2014-03-31
キーワードホスホリラーゼ / 基質特異性 / オリゴ糖合成 / Ruminococcus albus / マンナン / マンノオリゴ糖 / 加リン酸分解
研究概要

本研究では,偏性嫌気性細菌Ruminococcus albusに見出した新規な構造と機能を持つ二つのβ-1,4-マンノシルグルコースホスホリラーゼアイソザイム (I型とII型)の生化学的機能の解明と機能発現に重要な構造因子の決定を目的とした。本年度は大腸菌による組換え酵素の生化学的機能解析を実施した。二つの組換え酵素をそれぞれ電気泳動的に単一になるまで精製した。両酵素は共にpH 6.5で最大活性を示した。ゲル濾過とSDS-PAGEによる解析によりI型酵素は2量体,II型酵素は6量体であることが判明した。β-1,4-マンノシルグルコースの加リン酸分解反応の反応速度論的解析から,両酵素がいずれもランダム機構により加リン酸分解を触媒することを明らかにした。マンノース1-リン酸を糖供与体,様々な糖質を受容体として合成反応を行い,無機リン酸の遊離量から合成活性を評価した。I型酵素は天然の糖質ではグルコースとキシロースに合成活性を示したが、グルコースに対する活性の方が圧倒的に高かった。このことから本酵素はβ-1,4-マンノシルグルコースに特異的な酵素と考えられた。一方,II型酵素についてはグルコースよりセロビオースやマンノビオースのようなオリゴ糖を良い受容体とした。またII型酵素は3糖以上の重合度のマンノオリゴ糖に対してβ-1,4-マンノシルグルコースに対するよりも高い加リン酸分解活性を示した。このことから、II型酵素はマンノオリゴ糖の加リン酸分解を担う新規な糖質ホスホリラーゼであることが明らかになった。これらのことから,マンノオリゴ糖の代謝経路を推定した。すなわち,II型酵素によるマンノオリゴ糖の加リン酸分解,セロビオース2-エピメラーゼによるマンノビオースの異性化(β-1,4-マンノシルグルコースの生成),I型酵素によるβ-1,4-マンノシルグルコースの加リン酸分解,である。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度は,Ruminococcus albusの二つのβ-1,4-マンノシルグルコースホスホリラーゼアイソザイムの組換え酵素の調製と酵素機能の解析を計画していた。両酵素遺伝子をR. albusのゲノムDNAを鋳型としたPCRによりクローニングして,大腸菌による組換え酵素生産系を構築した。二つの酵素については,当該発現系を利用することで解析に十分な量の精製酵素を調製することが可能となった。これらの酵素の生化学的機能解析を実施し,計画通り基質特異性を中心とした生化学的性質を明らかにした。すなわち,I型酵素がβ-1,4-マンノシルグルコースに特異的な加リン酸分解酵素であること,II型酵素が当初β-1,4-マンノシルグルコースホスホリラーゼと思われていたが,マンノオリゴ糖に高い活性を持つ新規な糖質ホスホリラーゼであることを明らかにした。I型酵素とII型酵素の機能的相違については,本年度の解析を通じて得られた非常に興味深い知見であった。以上のことから,二つのアイソザイムの生化学的アイデンティティを与えることができたため,本年度の目標は十分に達成できたものと考えている。

今後の研究の推進方策

β-1,4-マンノシルグルコースホスホリラーゼの機能発現に重要な構造因子の特定と解析を行う.本酵素は新規な構造を持つ酵素であるため,活性中心も現時点では不明である。このため,I型酵素をモデルとして活性残基の決定を行う。β-1,4-マンノシルグルコースホスホリラーゼはα-マンノース1-リン酸を生じることから,アノマー型の反転を伴う加リン酸分解反応を触媒する反転型ホスホリラーゼである。このような反転型ホスホリラーゼは一般酸触媒として機能するアミノ酸残基が唯一の触媒残基として働く。まずはこの一般酸触媒残基を特定する。I型酵素とII型酵素のホモログのアミノ酸配列を多重整列し,完全に保存された酸性アミノ酸残基を特定する。特定された酸性アミノ酸残基を置換した変異酵素を作製し,活性の減少から触媒残基を決定する。次にI型酵素とII型酵素の基質特異性の違いを生じる構造因子を決定する。生化学機能は未知だが立体構造情報が利用できるThermotoga maritima由来TM1225タンパク質の立体構造情報を利用し,基質結合部位と推定されるポケット様構造を構成するアミノ酸残基をI型酵素とII型酵素間で詳細に比較する。I型酵素とII型酵素で明確に異なるアミノ酸残基をピックアップし,I型酵素のアミノ酸残基をII型酵素型に置換した一連の変異酵素を作製し,基質特異性を検討する.

次年度の研究費の使用計画

該当なし

  • 研究成果

    (24件)

すべて 2013 2012

すべて 雑誌論文 (6件) (うち査読あり 6件) 学会発表 (18件)

  • [雑誌論文] Identification and characterization of cellobiose 2-epimerase from various aerobes2013

    • 著者名/発表者名
      Teruyo Ojima, Wataru Saburi, Takeshi Yamamoto, Haruhide Mori, Hirokazu Matsui
    • 雑誌名

      Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry

      巻: 77 ページ: 189-193

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Crystal structure of Ruminococcus albus cellobiose 2-epimerase: structural insights into epimerization of unmodified sugar2013

    • 著者名/発表者名
      Takaaki Fujiwara, Wataru Saburi, Sota Inoue, Haruhide Mori, Hirokazu Matsui, Isao Tanaka, Min Yao
    • 雑誌名

      FEBS Letters

      巻: 587 ページ: 840-846

    • DOI

      10.1016/j.febslet.2013.02.007.

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Metabolic mechanism of mannan in a ruminal bacterium, Ruminococcus albus, involving two mannoside phosphorylases and cellobiose 2-epimerase: discovery of a new carbohydrate phosphorylase, β-1,4-mannooligosaccharide phosphorylase2012

    • 著者名/発表者名
      Ryosuke Kawahara, Wataru Saburi, Rei Odaka, Hidenori Taguchi, Shigeaki Ito, Haruhide Mori, Hirokazu Matsui
    • 雑誌名

      Journal of Biological Chemistry

      巻: 287 ページ: 42389-42399

    • DOI

      10.1074/jbc.M112.390336.

    • 査読あり
  • [雑誌論文] urification and characterization of a liuefying α-amylase from alkalophilic termophilic Bacillus sp. AAH-312012

    • 著者名/発表者名
      Daehoon Kim, Naoki Morimoto, Wataru Saburi, Atsushi Mukai, Koji Imoto, Toshihiko Takehana, Seiji Koike, Haruhide Mori, Hirokazu Matsui
    • 雑誌名

      Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry

      巻: 76 ページ: 1378-1383

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Immobilization of a thermostable cellobiose 2-epimerase from Rhodothermus marinus JCM9785 and continuous production of epilactose2012

    • 著者名/発表者名
      Hiroki Sato, Wataru Saburi, Teruyo Ojima, Hidenori Taguchi, Haruhide Mori, Hirokazu Matsui
    • 雑誌名

      Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry

      巻: 76 ページ: 1584-1587

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482 glycoside hydrolase family 66 homolog catalyzes dextranolytic and cyclization reactions2012

    • 著者名/発表者名
      Young-Min Kim, Wataru Saburi, et al.
    • 雑誌名

      FEBS Journal

      巻: 279 ページ: 3185-3191

    • DOI

      10.1111/j.1742-4658.2012.08698.x.

    • 査読あり
  • [学会発表] デキストラン合成酵素dextran dextrinaseの触媒残基およびその機能の決定2013

    • 著者名/発表者名
      貞廣 樹里,森 春英,佐分利 亘,奥山 正幸,木村 淳夫
    • 学会等名
      日本農芸化学会2013年度大会
    • 発表場所
      東北大学,仙台
    • 年月日
      20130324-20130328
  • [学会発表] Halomonas sp. H11株由来α-グルコシダーゼ組換え酵素の大腸菌による生産と諸性質2013

    • 著者名/発表者名
      城戸 悠輔,佐分利 亘,小島 晃代,森 春英,松井 博和
    • 学会等名
      日本農芸化学会2013年度大会
    • 発表場所
      東北大学,仙台
    • 年月日
      20130324-20130328
  • [学会発表] イネ由来ツベロン酸β-グルコシドグルコシダーゼアイソザイム1の機能解析2013

    • 著者名/発表者名
      武田 遼介,姫野 奈美,佐分利 亘,和久田 真司,森 春英,松浦 英幸,鍋田 憲助,今井 亮三,松井 博和
    • 学会等名
      日本農芸化学会2013年度大会
    • 発表場所
      東北大学,仙台
    • 年月日
      20130324-20130328
  • [学会発表] イネ由来ツベロン酸β-グルコシドグルコシダーゼアイソザイムのアグリコン認識メカニズムの解析2013

    • 著者名/発表者名
      姫野 奈美,佐分利 亘,武田 遼介,和久田 真司,松浦 英幸,鍋田 憲助,森 春英,今井 亮三,松井 博和
    • 学会等名
      日本農芸化学会2013年度大会
    • 発表場所
      東北大学,仙台
    • 年月日
      20130324-20130328
  • [学会発表] シロイヌナズナにおけるCYP94B2の機能解析2013

    • 著者名/発表者名
      天野 就基,北岡 直樹,川出 洋,谷口 沙希,佐分利 亘,松井 博和,松浦 英幸
    • 学会等名
      日本農芸化学会2013年度大会
    • 発表場所
      東北大学,仙台
    • 年月日
      20130324-20130328
  • [学会発表] COLD SHOCK DOMAIN PROTEIN 3 regulates salt and drought stress tolerance in Arabidopsis2013

    • 著者名/発表者名
      Shunya Sato, Myung-Hee Kim, Kentaro Sasaki, Wataru Saburi, Hirokazu Matsui, Ryozo Imai
    • 学会等名
      第54回日本植物生理学会年
    • 発表場所
      岡山大学,岡山
    • 年月日
      20130321-20130323
  • [学会発表] イネの傷害時のSAGをdonorとしたTAに対する糖転移反応2012

    • 著者名/発表者名
      竹松 知紀,宮沢 吉郎,瀬戸 義哉,和久田 真司,佐分利 亘,鍋田 憲助,松井 博和,松浦 英幸
    • 学会等名
      平成24年度日本農芸化学会北海道支部講演会
    • 発表場所
      北海道大学,札幌
    • 年月日
      20121102-20121102
  • [学会発表] 組換えツベロン酸グルコシドグルコシダーゼの酵素化学的諸性質の解析2012

    • 著者名/発表者名
      武田 遼介,姫野 奈美,佐分利 亘,和久田 真司,森 春英,松浦 英幸,鍋田 憲助,今井 亮三,松井 博和
    • 学会等名
      平成24年度日本農芸化学会北海道支部講演会
    • 発表場所
      北海道大学,札幌
    • 年月日
      20121102-20121102
  • [学会発表] ツベロン酸グルコシド加水分解酵素の基質認識機構の解明2012

    • 著者名/発表者名
      姫野 奈美,和久田 真司,武田 遼介,佐分利 亘,森 春英,松浦 英幸,鍋田 憲助,今井 亮三,松井 博和
    • 学会等名
      平成24年度日本農芸化学会北海道支部講演会
    • 発表場所
      北海道大学,札幌
    • 年月日
      20121102-20121102
  • [学会発表] Bacillus sp. AAH-31株由来耐熱性アルカリα-アミラーゼの高機能化に関する研究2012

    • 著者名/発表者名
      玉村 尚也,向井 惇,森本 奈保喜,竹花 稔彦,佐分利 亘,森 春英,小池 誠治,松井 博和
    • 学会等名
      平成24年度日本農芸化学会北海道支部講演会
    • 発表場所
      北海道大学,札幌
    • 年月日
      20121102-20121102
  • [学会発表] セロビオース2-エピメラーゼを用いたエピラクトースの実用的酵素合成法の開発2012

    • 著者名/発表者名
      佐分利 亘,小島 晃代,佐藤 央基,田口 秀典,森 春英,松井 博和
    • 学会等名
      応用糖質科学シンポジウム
    • 発表場所
      東京農工大学,東京
    • 年月日
      20120921-20120921
  • [学会発表] cellobiose phosphorylaseのepilactose phosphorylaseへの改変2012

    • 著者名/発表者名
      羽村 健,佐分利 亘,森 春英,松井 博和
    • 学会等名
      日本応用糖質科学会2012年度大会
    • 発表場所
      東京農工大学,東京
    • 年月日
      20120919-20120921
  • [学会発表] シロイヌナズナADP-glucose pyrophosphorylase遺伝子の発現制御因子の解析2012

    • 著者名/発表者名
      石塚 佐都子,和久田 真司,佐分利 亘,今井 亮三,松井 博和
    • 学会等名
      日本応用糖質科学会2012年度大会
    • 発表場所
      東京農工大学,東京
    • 年月日
      20120919-20120921
  • [学会発表] Ruminococcus albus NE1株由来マンノシルグルコースホスホリラーゼ (RaMP1) の一般酸触媒残基の解析2012

    • 著者名/発表者名
      尾高 伶,佐分利 亘,川原 良介,森 春英,松井博和
    • 学会等名
      日本応用糖質科学会2012年度大会
    • 発表場所
      東京農工大学,東京
    • 年月日
      20120919-20120921
  • [学会発表] Ruminococcus albus由来セロデキストリンホスホリラーゼの諸性質とリン酸結合部位の解析2012

    • 著者名/発表者名
      澤野 達也,佐分利 亘,森 春英,松井博和
    • 学会等名
      日本応用糖質科学会2012年度大会
    • 発表場所
      東京農工大学,東京
    • 年月日
      20120919-20120921
  • [学会発表] Ruminococcus albus由来セロビオース2-エピメラーゼ (RaCE) のX線結晶構造解析2012

    • 著者名/発表者名
      藤原 孝彰,佐分利 亘,井上 聡太,森 春英,松井 博和,姚 閔,田中 勲
    • 学会等名
      日本応用糖質科学会2012年度大会
    • 発表場所
      東京農工大学,東京
    • 年月日
      20120919-20120921
  • [学会発表] Biochemical characterization of two mannosyl glucose phosphorylase isozymes from Ruminococcus albus2012

    • 著者名/発表者名
      Wataru Saburi, Ryosuke Kawahara, Hidenori Taguchi, Haruhide Mori, Hirokazu Matsui
    • 学会等名
      26th International Carbohydrate Symposium
    • 発表場所
      Madrid City centre (Hotel Melia Castilla), Madrid, Spain
    • 年月日
      20120722-20120727
  • [学会発表] Domain organization and catalytic amino acids of dextran dextrinase: structural similarity to inverting glucodextranase in catalytic domain2012

    • 著者名/発表者名
      Haruhide Mori, Juri Sadahiro, Wataru Saburi, Masayuki Okuyama, Atsuo Kimura
    • 学会等名
      26th International Carbohydrate Symposium
    • 発表場所
      Madrid City centre (Hotel Melia Castilla), Madrid, Spain
    • 年月日
      20120722-20120727

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公開日: 2014-07-24  

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