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2014 年度 実施状況報告書

ピロリ菌型メナキノン生合成経路酵素群の立体構造解析及び反応機構解明

研究課題

研究課題/領域番号 24780097
研究機関信州大学

研究代表者

新井 亮一  信州大学, 学術研究院繊維学系, 助教 (50344023)

研究期間 (年度) 2012-04-01 – 2016-03-31
キーワード酵素反応機構 / MqnD / DHNA synthase / メナキノン / 生合成 / X線結晶構造解析 / 高度好熱菌 / 結晶中酵素反応
研究実績の概要

近年、放線菌や高度好熱菌、ピロリ菌等において従来知られていなかったメナキノン(ビタミンK2)生合成経路が新たに発見された。ヒト等は別の生合成経路を持つため、新規メナキノン生合成経路にある酵素群は、ピロリ菌等の病原菌に特異的な阻害剤開発の分子標的になりうると考えられている。そこで、本年度は新規メナキノン生合成経路の酵素の一つであるMqnDのさらなる反応機構の解明を目的として、メナキノン生合成経路酵素MqnD(野生型)結晶中で基質と反応させた後に、X線結晶構造解析による立体構造解析を行った。
T. thermophilus HB8由来のMqnDを大腸菌BL21Star(DE3)株を用いて大量発現し、熱処理による粗精製や各種カラムクロマトグラフィーにより、精製タンパク質溶液を得た。これを用いてハンギングドロップ法により結晶化し、結晶ドロップ中に基質cDHFLを加えることで結晶中で反応を進行させた。その後、結晶を液体窒素で凍結し、KEK放射光科学研究施設(Photon Factory)においてX線回折測定を行い、分子置換法により立体構造解析を行った。その結果、従来から同定されていた1,4-dihydroxy-6-naphthoateの電子密度が確認され、確かに結晶中で酵素反応が進行することがX線結晶構造解析により確認された。その他に、X線結晶構造解析の過程で解釈に時間を要する未解明の電子密度を発見した。このことは新奇な予想を超える結果につながる可能性が高いため、当初計画より研究期間を1年間延長し、さらに慎重を期して詳細な実験や解析を行うこととした。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究課題で第一目標としていた高度好熱菌由来 MqnD-基質複合体の立体構造解析に成功し、MqnDの酵素反応機構に関する新たな知見が得られたこと、さらに今回、MqnD(野生型)結晶中で基質と反応後にX線結晶構造解析を行ったところ、予想以上の結果につながる可能性のある結果を得たことより、おおむね順調に研究は進展していると考えられる。また、ピロリ菌由来MqnDの立体構造解析を目指して、既にピロリ菌MqnDの大量発現系も構築済みで、精製条件を検討中で、今後のさらなる研究発展に向けた準備も進めている。

今後の研究の推進方策

今回、MqnD(野生型)結晶中で基質が反応した後に、X線結晶構造解析で発見された未解明の電子密度をさらに詳細に解析した後、これまでのMqnDのX線結晶構造解析及び反応機構に関する研究結果をまとめて、学術論文として国際誌上で報告する。
さらに、解析したピロリ菌MqnDの立体構造を利用して、in silico及びin vitro阻害剤結合スクリーニングを行い、structure-based drug discoveryやfragment-based drug discoveryの手法等も利用して、抗菌剤リード化合物開発への応用を目指す。

次年度使用額が生じた理由

H26年度に発見した未解明の電子密度について、さらに詳細な実験や解析を行うために、経費を次年度に繰り越した。

次年度使用額の使用計画

上記の理由により、さらに慎重を期して酵素反応機構解明のためのX線結晶構造解析と生化学実験、及びシンポジウム・学会での発表を次年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てる。

  • 研究成果

    (24件)

すべて 2015 2014 その他

すべて 雑誌論文 (1件) (うち謝辞記載あり 1件) 学会発表 (22件) (うち招待講演 2件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] Crystal structure of glycine oxidase from Bacillus thuringiensis2015

    • 著者名/発表者名
      Sakura Ohishi, Takako Shiono, Yoshiaki Nishiya, Takaomi Nomura, Ryoichi Arai
    • 雑誌名

      Photon Factory Activity Report

      巻: 31 ページ: B 274

    • 謝辞記載あり
  • [学会発表] 配列パターンデザインによる人工蛋白質・ペプチドの創出と応用2014

    • 著者名/発表者名
      新井 亮一
    • 学会等名
      信州大学農学部バイオサイエンス若手研究会第4回シンポジウム
    • 発表場所
      信州大学農学部(長野県南箕輪村)
    • 年月日
      2014-12-17
    • 招待講演
  • [学会発表] ヒゲナガカワトビケラ由来新規シルク蛋白質及び関連蛋白質の同定、解析、発現系構築2014

    • 著者名/発表者名
      坂口真代、Xue Bai、山口裕子、野村隆臣、大川浩作、石川えり、塚田益裕、平林公男、新井亮一
    • 学会等名
      信州大学農学部バイオサイエンス若手研究会第4回シンポジウム
    • 発表場所
      信州大学農学部(長野県南箕輪村)
    • 年月日
      2014-12-17
  • [学会発表] ドメインスワップ二量体人工タンパク質を利用した蛋白質ナノブロックによる自己組織化ナノ構造の創製2014

    • 著者名/発表者名
      小林直也,柳瀬慶一,佐藤高彰,Michael H. Hecht,新井亮一
    • 学会等名
      信州大学農学部バイオサイエンス若手研究会第4回シンポジウム
    • 発表場所
      信州大学農学部(長野県南箕輪村)
    • 年月日
      2014-12-17
  • [学会発表] パターンデザインペプチドライブラリーを利用した天然変性蛋白質ターゲット分子高親和性ペプチドの開発と相互作用解析2014

    • 著者名/発表者名
      半田雅憲,寺西弘志,西村善文,新井亮一
    • 学会等名
      信州大学農学部バイオサイエンス若手研究会第4回シンポジウム
    • 発表場所
      信州大学農学部(長野県南箕輪村)
    • 年月日
      2014-12-17
  • [学会発表] メナキノン生合成系酵素MqnD の基質複合体及び生成物複合体の立体構造解析2014

    • 著者名/発表者名
      小松美沙紀,池田早希,松尾京子,大利 徹,新井亮一
    • 学会等名
      信州大学農学部バイオサイエンス若手研究会第4回シンポジウム
    • 発表場所
      信州大学農学部(長野県南箕輪村)
    • 年月日
      2014-12-17
  • [学会発表] 高度好熱菌由来メナキノン生合成酵素MqnD-基質・生成物複合体のX線結晶構造解析および酵素反応機構2014

    • 著者名/発表者名
      新井 亮一、池田 早希、小松 美沙紀、松尾 京子、大利 徹
    • 学会等名
      第37回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(横浜市)
    • 年月日
      2014-11-25 – 2014-11-27
  • [学会発表] パターンデザインペプチドライブラリーを利用した天然変性領域ターゲット分子高親和性ペプチドのデザインと相互作用解析2014

    • 著者名/発表者名
      半田 雅憲、寺西 弘志、高野 光則、西村 善文、新井亮一
    • 学会等名
      第37回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(横浜市)
    • 年月日
      2014-11-25 – 2014-11-27
  • [学会発表] デノボタンパク質WA20を利用したナノブロックによる自己組織化ナノ構造の創製2014

    • 著者名/発表者名
      小林 直也、柳瀬慶一、佐藤高彰、Michael H. Hecht、新井亮一
    • 学会等名
      第37回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(横浜市)
    • 年月日
      2014-11-25 – 2014-11-27
  • [学会発表] ヒゲナガカワトビケラ由来新規シルク蛋白質及び関連蛋白質の同定・解析および発現系構築2014

    • 著者名/発表者名
      坂口真代、白雪、山口裕子、志水誠、石原詩織、野村隆臣、大川浩作、石川えり、阿部康次、塚田益裕、平林公男、新井亮一
    • 学会等名
      第37回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(横浜市)
    • 年月日
      2014-11-25 – 2014-11-27
  • [学会発表] グリシンオキシダーゼの基質阻害様式に関する研究2014

    • 著者名/発表者名
      塩野 貴子、鈴村 菖、西矢 芳昭、新井 亮一、野村 隆臣
    • 学会等名
      第37回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(横浜市)
    • 年月日
      2014-11-25 – 2014-11-27
  • [学会発表] 小角X線散乱法による溶液中におけるユビキチンの静的構造解析2014

    • 著者名/発表者名
      稲野 紘一、柳瀬 慶一、小林 直也、新井 亮一、佐藤高彰
    • 学会等名
      第37回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(横浜市)
    • 年月日
      2014-11-25 – 2014-11-27
  • [学会発表] ドメインスワップ二量体人工蛋白質WA20を利用したタンパク質ナノブロックによる自己組織化ナノ構造の創製2014

    • 著者名/発表者名
      小林 直也、柳瀬慶一、佐藤高彰、Michael H. Hecht、新井亮一
    • 学会等名
      「細胞を創る」研究会7.0
    • 発表場所
      東京大学(東京都)
    • 年月日
      2014-11-13 – 2014-11-14
  • [学会発表] パターンデザインペプチドライブラリーを利用した、ターゲットタンパク質結合ペプチドの探索・獲得及び変異体デザイン2014

    • 著者名/発表者名
      半田 雅憲、寺西 弘志、西村 善文、新井亮一
    • 学会等名
      日本生物高分子学会2014年度大会
    • 発表場所
      信州大学繊維学部(長野県上田市)
    • 年月日
      2014-09-12 – 2014-09-13
  • [学会発表] Glycine oxidaseの基質阻害に関する構造基盤2014

    • 著者名/発表者名
      塩野 貴子、西矢 芳昭、新井 亮一、野村 隆臣
    • 学会等名
      日本生物高分子学会2014年度大会
    • 発表場所
      信州大学繊維学部(長野県上田市)
    • 年月日
      2014-09-12 – 2014-09-13
  • [学会発表] 高度好熱菌由来メナキノン生合成酵素MqnD-基質(cDHFL)複合体のX線結晶構造解析2014

    • 著者名/発表者名
      新井 亮一、池田 早希、小松 美沙紀、松尾 京子、大利 徹
    • 学会等名
      第8回バイオ関連化学シンポジウム
    • 発表場所
      岡山大学(岡山市)
    • 年月日
      2014-09-11 – 2014-09-13
  • [学会発表] デノボタンパク質WA20を利用したナノブロックによる自己組織化ナノ構造の創製2014

    • 著者名/発表者名
      小林 直也、柳瀬慶一、佐藤高彰、Michael H. Hecht、新井亮一
    • 学会等名
      第8回バイオ関連化学シンポジウム
    • 発表場所
      岡山大学(岡山市)
    • 年月日
      2014-09-11 – 2014-09-13
  • [学会発表] 配列パターンデザインライブラリーとファージディスプレイを用いたmSin3 PAH1ドメイン結合ペプチド配列の探索, 変異体デザイン, 及びBiacoreによる相互作用解析2014

    • 著者名/発表者名
      半田 雅憲、寺西 弘志、西村 善文、新井亮一
    • 学会等名
      GE Life Sciences Day 2014
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(横浜市)
    • 年月日
      2014-08-01
  • [学会発表] 配列パターンデザインによるデノボ蛋白質の半合理的創製とその応用2014

    • 著者名/発表者名
      新井亮一
    • 学会等名
      第14回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      ワークピア横浜(横浜市)
    • 年月日
      2014-06-25 – 2014-06-27
    • 招待講演
  • [学会発表] Geobacillus kaustophilus由来Glycine oxidaseのX線結晶構造解析2014

    • 著者名/発表者名
      塩野 貴子、新井 亮一、西矢 芳昭、野村 隆臣
    • 学会等名
      第14回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      横浜産貿ホール(横浜市)
    • 年月日
      2014-06-25 – 2014-06-27
  • [学会発表] デノボタンパク質WA20を利用したナノブロックによる自己組織化ナノ構造の創製2014

    • 著者名/発表者名
      小林 直也、柳瀬慶一、佐藤高彰、Michael H. Hecht、新井亮一
    • 学会等名
      第14回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      横浜産貿ホール(横浜市)
    • 年月日
      2014-06-25 – 2014-06-27
  • [学会発表] 配列パターンデザインとファージディスプレイを用いたPAH1結合天然変性領域配列の探索・変異体デザインおよびSPRセンサーによる相互作用解析2014

    • 著者名/発表者名
      半田 雅憲、寺西 弘志、高野 光則、西村 善文、新井亮一
    • 学会等名
      第14回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      横浜産貿ホール(横浜市)
    • 年月日
      2014-06-25 – 2014-06-27
  • [学会発表] ヒゲナガカワトビケラ由来新規シルク蛋白質及び関連蛋白質の網羅的同定と解析2014

    • 著者名/発表者名
      白雪、山口裕子、野村隆臣、大川浩作、石川えり、塚田益裕、阿部康次、平林公男、新井亮一
    • 学会等名
      第14回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      横浜産貿ホール(横浜市)
    • 年月日
      2014-06-25 – 2014-06-27
  • [備考] 生物資源・環境科学課程 新井亮一 助教が酵素工学奨励賞を受賞

    • URL

      http://www.shinshu-u.ac.jp/faculty/textiles/news/2015/04/62170.html

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公開日: 2016-06-01  

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