| 研究課題/領域番号 |
24780115
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| 研究機関 | 大阪府立大学 |
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研究代表者 |
甲斐 建次 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 助教 (40508404)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| キーワード | クオラムセンシング |
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| 研究概要 |
接合菌Mortierella alpinaの細胞中にはエンドバクテリアが存在する。この接合菌と細菌の相互関係（共生）確立にはアシルホモセリンラクトン（AHL）を介したクオラムセンシング（QS）が重要な役割を担っていることが示唆されている。本申請課題では、このユニークな共生を成立・維持する上でのQSの機能と、その分子メカニズムの解明への基盤構築を目指している。平成24年の目標の１つであったAHLアンタゴニストをM. alpinaに処理し、AHL産生量や菌の形態の変化を精査した。その結果、アンタゴニスト処理により目立った変化は起こらないことが分かった。本内容はこれまで未発表の内容も含めて、ChemBioChem誌に発表した。もう1つの目標であったAHL生合成遺伝子のクローニングは難航している。M. alpina内に共生するバクテリアの純粋培養に成功していない。Rhizopus－Burkholderia系をモデルとして、エンドバクテリアの単離、再導入実験を検討し、それらの目的を達成することができた。現在、これらの知見を用いて、M. alpinaからエンドバクテリア単離を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
エンドバクテリアのAHL生合成遺伝子のクローニングに成功していない点は遅れていると判断せざるを得ない。しかし、本共生系に関する基礎的知見とホストからのエンドバクテリア除去に成功したことにより得られた知見などは、本研究の対象であるカビとバクテリアの細胞内共生関係というユニークな生命現象解明に十分寄与している。
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| 今後の研究の推進方策 |
AHL生合成遺伝子のクローニング達成を目指す。エンドバクテリアをホスト細胞内から単離・純粋培養し、ゲノム解読を行い、AHL生合成酵素候補遺伝子を探す。もう１つ別のアプローチとして、AHL生合成酵素阻害剤をリガンドとしたプルダウンアッセイによるAHL生合成酵素の同定を考えている。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
エンドバクテリアをホスト細胞から単離・純粋培養する。それに成功したら、ドラフトのゲノム解析を外注して行い、AHL生合成候補遺伝子を抽出する。候補遺伝子をクローニングし、大腸菌で発現させてAHL合成酵素遺伝子であるかどうかを判断する。
エンドバクテリアの純粋培養に成功しそうにないときは、AHL生合成酵素阻害剤をリガンドとしたアフィニティ―ゲルを作製する。プルダウン法を開発し、モデル系でAHL合成酵素をトラップできるかどうかを判断する。上手く行くことが分かれば、M. alpinaから粗酵素画分を調製し、プルダウン法によりAHL生合成酵素を同定する。酵素が同定できれば、アミノ酸配列を読み、プライマーをデザインし、AHL生合成遺伝子をクローニングする。
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