| 研究概要 |
本研究の目的は、ウイルス性神経壊死症ウイルス(NNV)の組換えコートタンパク質からウイルス様粒子(VLP)を調製し、このVLP中にDNAワクチンを封入することで、効率的にDNAワクチンを魚に投与出来るかどうかを確認することである。
平成24年度は、組換えコートタンパク質の調製およびVLPの精製を行った。ヒラメから分離されたNNVのJFIwa98株からゲノムRNAを抽出したのち、RT-PCRを行いコートタンパク質遺伝子を増幅した。増幅したコートタンパク質遺伝子をpET-32aプラスミドベクターに挿入しpET-NNVcoatを構築した。大腸菌BL21株にpET-NNVcoatを導入したのち、Luria-Bertani (LB) 液体培地中でOD600=0.4になるまで培養した。0.84mMとなるようにIPTGを加え組換えコートタンパク質の発現誘導を行った。遠心分離によって培養菌体を回収したのち、リゾチームと界面活性剤により菌体を破壊した。破壊した菌体の遠心上清を30%ショ糖液上に重層し 285,000 xgで１時間遠心分離した。沈澱を緩衝液(10mM Tris-HCl, pH8.0)に再懸濁し、さらに20-40%ショ糖連続密度勾配による遠心分離を100,000 xgで12時間行い、VLPが含まれるバンドを回収した。
平成25年度は精製したVLPにDNAワクチンが封入できるかどうかを確認し魚体への投与試験を行う。
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