魚類における複合糖鎖および関連酵素の生理機能解析

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24780204
• 研究機関: 鹿児島大学
• 研究代表者: 塩崎 一弘 鹿児島大学, 水産学部, 助教 (70390896)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: シアリダーゼ / メダカ

研究実績の概要

シアリダーゼは糖脂質や糖タンパクの非還元末端よりシアル酸を遊離させる酵素である。哺乳類ではシアリダーゼが細胞の分化やアポトーシスなどに関与する事が知られているが、一方魚類ではほとんど知見が得られていない。昨年度に引き続き、魚類における糖鎖分解酵素シアリダーゼの酵素学的性状解析、および生理機能の解明を目的として研究を行った。
1)魚類シアリダーゼのクローニングと性状解析：メダカシアリダーゼのうちクローニングが行われていなかったneu1について解析を行い、その遺伝子配列を明らかにした。その酵素活性化にはカテプシンAが必要であることが予想されたため、この遺伝子クローニングも併せて行った。これらの配列については遺伝子データベースに登録を行った。（neu1:AB905208, ctsa:AB968232)。また養殖対象魚としてナイルティラピアも試料として用い、5つのシアリダーゼ遺伝子(neu3a:AB933557、neu3b: AB933558、neu3c:AB933559、neu3d:AB933560、neu3e:AB933561)のクローニング、およびデータベース登録も行った。
2)魚類シアリダーゼの生理機能解析：メダカNeu3bが孵化直後に発現が上昇することに注目し、筋分化への影響について検討を行った。筋芽細胞にneu3b遺伝子を導入し筋管細胞への分化を誘導したところ、neu3b導入細胞では分化の促進が認められた。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

予定していたメダカシアリダーゼのクローニングおよび性状解析はほぼ終了しており、細胞や個体を用いた機能解析に取り掛かり、その成果の一部を学会発表するなど順調に計画を達成できている。また研究課題から発展したティラピアを用いた解析も進んでいる。
本年度の研究成果については英文雑誌2報に投稿、既に受理されている。（Shiozaki, K et al., ,Molecular cloning and biochemical characterization of medaka (Oryzias latipes) lysosomal neu4 sialidase Fish Physiol Biochem, 40, 1461-1472, 2014：Chigwechokha, P et al., Nile Tilapia Neu3 sialidases: molecular cloning, functional characterization and expression in Oreochromis niloticus. Gene, 552, 155-64, 2014)。以上の理由から、本課題は現在まで研究の目的について、当初の計画以上に進展していると評価を行った

今後の研究の推進方策

最終年度では遺伝子改変メダカの作成および解析により魚類シアリダーゼの生理機能を明らかにすることを予定している。これは当初に計画した内容であるが、遺伝子改変技術が進歩したため、ノックアウトメダカ作成方法については計画とは異なる。遺伝子改変としてモルフォリノオリゴによる遺伝子ノックダウン、並びにCRISPR/Cas9によるノックアウトを用いる。これらの遺伝子改変動物の作成は既に本年度より進められている。評価方法としてフェノタイプの観察、および組織切片の解析による形態学的観察を主として行う。糖鎖分解酵素のノックダウンでは糖タンパクや糖脂質の蓄積が予想されており、各組織における糖鎖構造の解析も必要である。

研究成果

• [雑誌論文] Molecular cloning and biochemical characterization of medaka (Oryzias latipes) lysosomal neu4 sialidase (2014)
  • 著者名/発表者名: Shiozaki, K., Ryuzono, S., Matsushita, N., Ikeda, A., Takeshita, K., Chigwechokha, P., Komatsu, M., Miyagi, T.,
  • 雑誌名: Fish Physiol Biochem 巻: 40 ページ: 1461-1472
  • DOI: 10.1007/s10695-014-9940-9
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Nile Tilapia Neu3 sialidases: molecular cloning, functional characterization and expression in Oreochromis niloticus. (2014)
  • 著者名/発表者名: Chigwechokha, P., Komatsu, M., Itakura, T., Shiozaki, K
  • 雑誌名: Gene 巻: 552 ページ: 155-64
  • DOI: 10.1016/j.gene.2014.09.029
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] Molecular cloning and characterization of gaglioside specific sialidase in tilapia (2014)
  • 著者名/発表者名: Chigwechokha, P., Itakura T., Komatsu, M., Shiozaki, K
  • 学会等名: 平成26年度日本水産学会秋季大会
  • 発表場所: 九州大学（福岡県福岡市）
  • 年月日: 2014-09-21 – 2014-09-21
• [学会発表] 筋分化におけるメダカシアリダーゼNeu3bの機能解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 原崎裕介、池田麻美、龍薗せな、吉川みのり、大石一樹、小松正治、塩崎一弘
  • 学会等名: 平成26年度日本水産学会秋季大会
  • 発表場所: 九州大学（福岡県福岡市）
  • 年月日: 2014-09-20 – 2014-09-20
• [学会発表] ニホンメダカOryzias latipesのシアリダーゼ研究におけるモデル動物としての有用性 (2014)
  • 著者名/発表者名: 龍薗せな、池田麻美、原崎裕介、大石一樹、小松正治、宮城妙子、塩崎一弘
  • 学会等名: 第33回日本糖質学会年会
  • 発表場所: 名古屋大学（愛知県名古屋市）
  • 年月日: 2014-08-09 – 2014-08-09