研究課題
DNA相同組換え修復酵素であるRAD51は、電離放射線等によるDNAの2本鎖切断発生時における相同組換え修復に必須である。しかし、RAD51高発現がん細胞においては相同組換え修復効率の亢進により放射線治療抵抗性が生じる場合がある。本申請課題においては、腫瘍性疾病が多いイヌより分離した種々のがん組織由来株化細胞を用い、RAD51の発現量と放射線治療抵抗性の相関を探るとともに、機能分子BRC repeatを用いた、RAD51を基軸とするDNA相同組換え修復効率の制御を標的とした新規治療戦略の開発に向けた臨床応用研究を行ことを目的とした。研究年度2年目の平成25年度においては本申請課題の研究成果であるYoshikawa et al., 2012. PLoS ONE（Effects of the Missense Mutations in Canine BRCA2 on BRC Repeat 3 Functions and Comparative Analyses between Canine and Human BRC Repeat 3.）で明らかとなったヒトRAD51とイヌRAD51におけるBRCA2との相互作用様式の相違について研究を展開した。具体的にはヒトとイヌのRAD51で異なるアミノ酸に着目し、BRCA2との相互作用強度を定量化し、どのアミノ酸がRAD51-BRCA2複合体形成に重要かを精査した。その過程でこれまでに注目されていなかったRAD51構成アミノ酸がRAD51ホモオリゴマー形成に重要であることを部分的に解明するに至った。この結果は比較生物学的見地から導き出された画期的成果であり、本研究を今後推進することによってRAD51が持つ生物種を超えた普遍的な機能の一端を解明する一助となると考えられる。また、本研究で同定されたRAD51機能に影響を及ぼすアミノ酸をイヌで精査することにより、イヌの乳腺腫瘍独自の放射線感受性および抵抗性についても明らかにできる可能性があるため、今後さらに研究を推進する予定である。
2: おおむね順調に進展している
当該年度においては、本申請課題の研究成果であるYoshikawa et al., 2012. PLoS ONE（Effects of the Missense Mutations in Canine BRCA2 on BRC Repeat 3 Functions and Comparative Analyses between Canine and Human BRC Repeat 3.）で明らかとなったヒトRAD51とイヌRAD51が相互作用分子であるBRCA2との相互作用様式に違いがあることに注目して研究を展開した。ヒトとイヌのRAD51で異なるアミノ酸についてヒト型からイヌ型へのアミノ酸置換を実験的に行い、細胞内でのタンパク質―タンパク質相互作用強度定量法であるMammalian Two-Hybrid assayを行い、RAD51-BRCA2相互作用に大きな影響を与える新規アミノ酸を同定した。その結果、ヒトRAD51に比べてイヌRAD51は定常状態でのホモオリゴマー形成能力が低い可能性が示唆された。今後は細胞生物学的手法に加え、コムギ由来無細胞タンパク質発現系を用いて発現・精製したRAD51タンパク質を用い、生化学的手法等を用い様々な角度から本現象を明らかにし、イヌRAD51独特の機能を解明していきたい。また、本研究年度においては、イヌの乳腺腫瘍由来細胞株8種類におけるRAD51発現状況を精査した。RAD51は細胞周期の中でDNA合成期に発現が亢進する。そのため、複数の細胞株における本遺伝子およびタンパク質発現を評価するには同一細胞周期でのサンプリングが必要である。そのため、無血清培養での細胞周期G0期への同期化を行い、その後、血清添加培地での培養を行ってDNA合成期でのサンプリングを行い各種乳腺腫瘍細胞株におけるRAD51タンパク質発現量を定量した。本実験手法の確立は今後、RAD51過剰発現細胞株の放射線治療抵抗性を評価するうえで必要不可欠であると考えられるため、最終研究年度においても継続すべき課題とした。
平成25年度に進行したRAD51-BRCA2およびRAD51-RAD51相互作用に大きな影響を及ぼす可能性があるアミノ酸について、ヒトRAD51の野生型（WT）を基軸として、PCR変異導入法を用いて作製した各種クローンについて、愛媛大学プロテオサイエンスセンター無細胞生命科学部門で実施しているコムギ由来無細胞タンパク質合成系を用いてRAD51タンパク質の発現及び精製を行う。そこで得られた精製タンパク質を用いてヒト型→イヌ型アミノ酸置換を行った各種RAD51の性状解析を行う予定である。具体的にはヒトWT RAD51をプレートに固相化し、6×His-tag付き各種RAD51を反応させてRAD51-RAD51相互作用したタンパク質量をHis-tagに対する抗体反応で検出する。また、HPLC等の分析機器を用いて各種RAD51におけるオリゴマー形成状況の数値化を試みる。DNAの2本鎖切断時におけるRAD51反応はホモオリゴマー状態からのモノマー形成から始まると考えられているため、本研究課題で発見されたRAD51オリゴマー形成に重要な役割を果たすアミノ酸の機能評価にはDNA組換え効率の定量が適している。平成26年度においては、蛍光標識した相同DNA鎖を用いてATP存在下における各種精製RAD51タンパク質によるDNA鎖交換効率の定量化を試みる。各種RAD51-DNA複合体と組換えを受けたDNA鎖の量比を電気泳動等で評価することにより、各種RAD51すなわちアミノ酸置換体ごとのDNA組換え効率を算出し、ヒトとイヌのDNA相同組換え効率について比較・検討する。
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