| 研究課題/領域番号 |
24790036
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
佐々木 章 北海道大学, 先端生命科学研究科(研究院), 博士研究員 (30580162)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 遺伝子デリバリー / 蛍光相互相関分光法 / 画像相関 / 生物物理 / DNA / 蛍光イメージング / １分子計測 |
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| 研究概要 |
外来遺伝子を体内に導入し、タンパク質を発現させたり目的遺伝子をノックダウンしたりする「外来遺伝子発現システム」の全体像を理解するには、細胞内における外来DNAの運命を定量化することが不可欠である。しかし、生細胞内で動的に変化する外来DNAの局在や分解を時空間的かつ定量的に表現することは未だ実現されていない。
本研究の目的は、生細胞内における外来DNAの拡散・分解などの運命の可視化ならびに単一細胞内のタンパク質発現量の定量的測定を通じ、外来遺伝子に対する防御に関与するヌクレアーゼの同定を行い、それらを制御することで外来遺伝子発現を高効率化することである。
今年度は、生細胞内における外来DNAの分解を可視化するための蛍光標識DNA分解プローブを作成し、それらを生細胞内にマイクロインジェクションによって導入する実験系を構築した。また、導入したDNAプローブの動態を解析するための手法として、ccRICS（Cross-correlation raster-scan image correlation spectroscopy）法の確立を行った。ccRICS解析プログラムを新規に開発し、生きた細胞内におけるDNAプローブの分解を時空間的にマッピングすることに成功した。今までの蛍光イメージング測定から、導入された外来DNAは時間が経過すると核に移行する現象が観察されていたが、本解析によって核に移行したDNAは細胞質ですでに分解を受けた断片が大半であることが新たに明らかになった。
今後は、種々の細胞株においてヌクレアーゼの活性を可視化し比較することで細胞種によるヌクレアーゼ活性の違いを評価する。また、RNAi等を駆使してヌクレアーゼ活性を阻害することによってDNA分解速度が変化するかどうか、また、DNA分解活性と遺伝子発現効率の相関を明らかにしていく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度の当初達成目標はDNA 分解経路の定量的可視化法、すなわち測定系の確立であった。具体的な課題としては、①蛍光標識DNA分解プローブの作成、②外来DNA を細胞内に定量的に導入する方法としてのマイクロインジェクション、③ccRICS解析プログラムの開発、④条件の最適化と測定である。
蛍光標識DNA分解プローブは、修飾する色素の選択と鎖長、配列をデザインし作成した。作成したDNAプローブを水溶液中において蛍光相互相関分光法（FCCS）で測定したところ、高い相互相関値が得られ、プローブとして利用可能であることが示された。次に、細胞へのマイクロインジェクションを試みた。装置の安定性にやや難がありスループットは高くないもののDNAプローブの細胞内導入が可能な段階まで手技を向上した。同時にccRICSの画像相関解析プログラムを作成した。ccRICS法は一般的な使用法であればすでに顕微鏡メーカー等からソフトウェアが入手可能である。しかし、本研究は画像の任意の空間における相互相関度を時間方向に解析することを目的としており、そのような解析手法は自分で作成する必要があった。このプログラムによって、蛍光タイムラプス測定を相互相関タイムラプスに変換することが可能になった。実際にCOS7細胞にDNAプローブをマイクロインジェクションし、１時間程度のタイムラプス測定を行いその間にDNAプローブが分解されていく様子を動画として可視化することに成功した。
以上の結果から、今年度予定していた「測定系の確立」に関しては、次の目標である酵素活性の細胞種間の比較や発現効率測定にアプローチ可能な段階まで達成されており、概ね順調に進展したと思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
予定していた通り、今年度までに測定系の土台を確立することができた。そこで来年度以降は構築した測定系を利用し、まず種々の細胞株においてヌクレアーゼの活性を可視化し比較することで細胞種によるヌクレアーゼ活性の違いを評価する。また、導入するDNAプローブのサイズを変化させた場合の核移行度のサイズ依存性を明らかにする。検出したヌクレアーゼ活性を外来遺伝子発現効率と照らし合わせることで、ヌクレアーゼ活性と発現効率間の相関を明らかにする。次に、RNAi 法を用い外来遺伝子の分解に関与する酵素をノックダウンすることで酵素活性を制御する。これは本来働くべき外来遺伝子に対する防御機構を破壊する作業である。その後、確立した手法を用いて外来DNA 分解ならびに制御の結果である発現効率を定量する。ヒト細胞内のヌクレアーゼ群は数十種類知られているが、ノックダウンする酵素は、DNase I, II, IV やExonucleaseIIIなど、エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼ両方を網羅的に選択することが理想である。本研究では、過去の研究結果から予想された分解メカニズムを持つエキソヌクレアーゼ群についてまず重点的に解析する予定である。発現効率と実際のDNA 分解活性を合わせて解析することで効率的な遺伝子発現に対するバリアーとなっている分解酵素を同定する。効率的にヌクレアーゼの同定を進めるための工夫として、マグネシウムイオンの枯渇やヌクレアーゼ阻害剤の利用も同時に進める。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
次年度経費の使途として、新たに実験に供する細胞株５種程度の購入と培養資材、サイズの異なるDNAプローブ作成のための材料、RNAi 法に用いるためのsiRNA と認識抗体を予定している。ノックダウンするヌクレアーゼの種類に関しては、網羅的に行うことが理想であるが、測定によって予想された分解メカニズムと照らし合わせながら用いるsiRNA の種類を数種類に絞り込む。また、ヌクレアーゼの特定に寄与するインヒビター等の試薬の購入も予定している。また、画像相関解析を加速するため、デスクトップPC、解析プログラム作成用ソフトウェア（MATLAB）とグラフ作成ソフトウェアOriginの導入を検討している。また、研究の進捗状況に応じて、単一細胞レベルでの遺伝子発現定量のためのマイクロ流体デバイスの設計とシステム構築に着手するためのMEMSや顕微鏡ステージを購入する。
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