研究課題
高尿酸血症の主な原因として腎臓の尿酸排泄低下が挙げられるが、腎臓における尿酸輸送の解明は進んでいない。放射性標識尿酸の取り込みを定量する現在の尿酸輸送評価法では、測定に多くの時間を要し、生細胞における尿酸輸送の経時的解析が不可能である。また複数の尿酸トランスポーターの相互連関を明らかにすることができない等の欠点が存在する。本研究では、組み換え蛍光タンパク質と尿酸代謝酵素uricaseの融合タンパク質を構築し、細胞内尿酸の蛍光検出法を開発することにより、①尿酸トランスポーター機能の簡便な定量評価、②細胞内尿酸分布の蛍光イメージングから、尿酸輸送機構の詳細を明らかとすることを目的とした。結果、設計した数種のバリアントから、尿酸代謝能および蛍光活性を保持した融合タンパク質を得た。活性を確認した融合タンパク質を発現した大腸菌に尿酸を添加し、蛍光プレートリーダーによって蛍光値を定量することによって、尿酸量に応じた蛍光値の変化を示すことを確認した。さらに、尿酸トランスポーターURAT1を腎由来培養細胞株に発現させる手法を確立した。発現の確認は抗URAT1抗体による免疫染色およびRT-PCRにより行った。そのURAT1発現細胞に構築した融合タンパク質をコードするベクターを遺伝子導入し、融合タンパク質を発現させた。融合タンパク質を発現するURAT1発現細胞に尿酸を添加した際の蛍光の経時的変化を蛍光プレートリーダーによりモニタリングした。蛍光の定量結果から、尿酸添加量に依存して融合タンパク質の蛍光変化が見られることを確認した。URAT1阻害薬を添加した際にはそのような蛍光変化が見られないことから、URAT1による尿酸輸送を融合タンパク質により蛍光検出可能であることを示した。
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