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2012 年度 実施状況報告書

新規GPCRシグナル検出系TGFα切断アッセイを用いたGPCRのリガンド探索

研究課題

研究課題/領域番号 24790064
研究機関東北大学

研究代表者

井上 飛鳥  東北大学, 薬学研究科(研究院), 助手 (50525813)

研究期間 (年度) 2012-04-01 – 2014-03-31
キーワードGタンパク質共役型受容体 / GPCR / オーファン / TGFα / リゾリン脂質 / リゾホスファチジルセリン / P2Y10 / GPR174
研究概要

Gタンパク質共役型受容体(GPCR)は、ヒトゲノムにおいて最大の遺伝子ファミリーを形成し、様々な生理的・病理的現象に関与する。また、GPCRは重要な創薬標的である。ロドプシンファミリーには、いまだリガンドが同定されていないGPCRが約65種類存在する。これらオーファンGPCRのリガンドを同定することは、GPCRの生理・病理機能の解明や創薬に密接に関わる重要な研究である。研究代表者はこれまでに、トランスフォーミング増殖因子アルファ(TGFα)のエクトドメイン切断を指標とした新規のGPCR活性化検出系(TGFα切断アッセイ)を確立した。本研究ではこのTGFα切断アッセイを用いてオーファンGPCRのリガンド同定を目指すとともに、TGFαエクトドメイン切断に関与するシグナルを解析した。
種々の生理活性に対するオーファンGPCRのスクリーニングの結果、リゾホスファチジルセリン(LysoPS)により活性化される3種類のGPCR(P2Y10, GPR174, A630033H20)を見出した(Inoue et al. Nat Methods 9, 1021 2012)。これら3種類のGPCRはLysoPS特異的に応答し、構造の類似した他のリゾリン脂質には全く反応しなかった。また、マスト細胞上の脱顆粒反応を誘導するLysoPSアナログのリゾホスファチジルスレオニンに対しては全く応答しなかったことから、マスト細胞で脱顆粒応答を担うLysoPS受容体はこれら3種類のGPCRとは異なるものと考えられる。
TGFα切断に関与するシグナルを解析したところ、GqシグナルとG12シグナルがTGFα切断応答を引き起こすことがわかった。一方、GsシグナルやGiシグナルはTGFα切断応答を引き起こさなかった。既存のGPCR活性化検出法と比べて、TGFα切断アッセイは特にG12シグナルの効率的な検出に優れていた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

オーファンGPCRのリガンド同定には多くの研究者が取り組んできており、汎用されているアッセイ系では限り新たなリガンド同定は困難と考えられる。研究代表者は、独自に構築したTGFα切断アッセイを用いて、オーファンGPCRのリガンドスクリーニングを行い、3種類のGPCR(P2Y10, GPR174, A630033H20)が生理活性脂質のリゾホスファチジルセリン(LysoPS)により活性化されることを見出した。興味深いことに、これらLysoPS受容体は、G12と共役することがわかった。既存のGPCR活性化検出法ではG12シグナルを検出することは難しい。G12シグナルを高感度・高精度に検出することのできるTGFα切断アッセイを用いることで初めて同定が可能となったと考えられる。
TGFα切断応答には、G12シグナルに加えてGqシグナルも関与していた。一方、GsシグナルやGiシグナルはTGFα切断応答を引き起こさなかった。そこで、キメラGαサブユニット(C末6アミノ酸の配列をGαsやGαiと置換)やGα15サブユニットを用いることで、GsやGiと共役するGPCRの活性化を検出することができた。この結果、約9割ものGPCRの活性化を単一のアッセイ系条件で検出することに成功した。この割合は既存のどのGPCR検出系よりも高かった。
以上より、オーファンGPCRのリガンド同定と適用可能なGPCRの拡張に成功していることから、当初の計画以上に進展していると評価している。

今後の研究の推進方策

前年度に引き続き、TGFα切断アッセイを用いて、オーファンGPCRのリガンド同定を目指す。候補化合物として、特に生理活性を示す脂質であるリゾホスファチジルスレオニン、リゾホスファチジルグルコース、酸化リン脂質に着目する。
TGFα切断アッセイは既存のGPCR活性化検出法に比べて、高精度・高感度であることとキメラGαサブユニットを利用可能であることから、TGFα切断アッセイを拡張してGPCRと三量体Gタンパク質との共役活性を評価する手法を構築することを目指す。具体的には、アッセイに用いる細胞(HEK293細胞)に内在に発現するGqとG12を阻害し、キメラGαサブユニットを共発現させた時のTGFα切断応答の回復を評価する。すなわち、GαサブユニットのC末との共役活性を指標に、GPCRの三量体Gタンパク質と共役活性を評価する。

次年度の研究費の使用計画

研究費は主に細胞培養の消耗品試薬を購入するのに使用する。また、成果発表として、学会参加の旅費と論文投稿料も計上する。

  • 研究成果

    (9件)

すべて 2013 2012 その他

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件) 学会発表 (4件) 備考 (1件) 産業財産権 (1件)

  • [雑誌論文] Phosphorothioate analogs of sn-2 radyl lysophosphatidic acid (LPA): Metabolically stabilized LPA receptor agonists2013

    • 著者名/発表者名
      Jiang, G. Inoue, A. Aoki, J. Prestwich, G. D.
    • 雑誌名

      Bioorg Med Chem Lett

      巻: 23 ページ: 1865-1869

    • DOI

      doi: 10.1016/j.bmcl.2013.01.002

    • 査読あり
  • [雑誌論文] TGFalpha shedding assay: an accurate and versatile method for detecting GPCR activation2012

    • 著者名/発表者名
      Inoue, A. Ishiguro, J. Kitamura, H. Arima, N. Okutani, M. Shuto, A. Higashiyama, S. Ohwada, T. Arai, H. Makide, K. Aoki, J.
    • 雑誌名

      Nat Methods

      巻: 9 ページ: 1021-1029

    • DOI

      doi:10.1038/nmeth.2172

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Synthesis and biological evaluation of optically active Ki164252012

    • 著者名/発表者名
      Sato, T. Sugimoto, K. Inoue, A. Okudaira, S. Aoki, J. Tokuyama, H.
    • 雑誌名

      Bioorg Med Chem Lett

      巻: 22 ページ: 4323-4326

    • DOI

      doi: 10.1016/j.bmcl.2012.05.012

    • 査読あり
  • [学会発表] TGFα切断を用いたGPCRと三量体Gタンパク質の共役活性の評価系の確立2013

    • 著者名/発表者名
      井上飛鳥、青木淳賢
    • 学会等名
      日本薬学会第133年会
    • 発表場所
      横浜
    • 年月日
      20130328-20130330
  • [学会発表] 毛髪形成メカニズムから派生したGタンパク質共役型受容体(GPCR)の新規検出系の開発とその応用2012

    • 著者名/発表者名
      井上飛鳥、石黒純、巻出久美子、青木淳賢
    • 学会等名
      第85回日本生化学会大会
    • 発表場所
      福岡
    • 年月日
      20121214-20121216
  • [学会発表] TGFα切断を用いた脂質メディエーター受容体の検出法の開発2012

    • 著者名/発表者名
      井上飛鳥、石黒純、巻出久美子、青木淳賢
    • 学会等名
      第54回日本脂質生化学
    • 発表場所
      福岡
    • 年月日
      20120607-20120608
  • [学会発表] Development of a versatile GPCR assay and its application for ligand identification of orphan GPCRs2012

    • 著者名/発表者名
      Asuka Inoue, Jun Ishiguro, Kumiko Makide and Junken Aoki
    • 学会等名
      LIPID MAPS Annual Meeting 2012
    • 発表場所
      San Diego, USA
    • 年月日
      20120507-20120508
  • [備考] 東北大学大学院薬学研究科分子細胞生化学分野

    • URL

      http://www.pharm.tohoku.ac.jp/~seika/H24/index.html

  • [産業財産権] 自己免疫疾患治療薬2012

    • 発明者名
      青木淳賢、巻出久美子、井上飛鳥、大和田智彦他
    • 権利者名
      青木淳賢、巻出久美子、井上飛鳥、大和田智彦他
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      WO 2012157746 A1
    • 出願年月日
      2012-05-18

URL: 

公開日: 2014-07-24  

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