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本研究の目的は、肝臓特異的な内皮細胞である肝類洞内皮細胞の発生機序を解明することである。肝類洞内皮細胞は、肝臓の発生と再生、肝臓内の血流調整さらには免疫反応など重要な役割を担っている。しかしながら、肝類洞内皮細胞の発生機序については未だほとんどが未解明の状態である。申請者は、過去の肝類洞内皮細胞の知見より「肝細胞の前駆細胞である肝芽細胞が肝類洞内皮細胞の発生に関与している」という仮説を立てた。本研究では、①肝芽細胞欠損マウスによる肝類洞内皮細胞の発生状態のin vivo解析、②肝芽細胞と中胚葉組織の共培養実験系によるin vitro解析によりこの仮説検証を行なう。
①当初、肝芽細胞欠損マウスとしてAlb-DT-Aマウスの作出を行なう予定であったが、その作出と維持に困難が予想される為、Hhex欠損マウスの作出を行なった。作出の方法はMartinez Barbera JP (Development. 2000)を参考にし、mHhexのターゲティングベクターを作製、C57BL/6Nマウス由来のES細胞にエレクトロポレーション法により導入した。168クローンのES細胞を樹立し、サザンブロティングにより相同組み換えが起こっているクローンを選別したが、樹立したESクローン中に相同組み換えを示すクローンは見つからなかった。そこで、CRISPR-CAS9システムを用いてHhex欠損マウスの作出を試みた。mHhexのfirst ATG付近20bpの配列を組み込んだCRISPR-CAS9発現ベクターを、C57BL/6N由来の１細胞期または２細胞期胚に導入した。E13.5でマウス胚を回収した結果、６匹中４匹がホモ欠損であった。この得られたホモ欠損胚の肝類洞内皮細胞の発生状態の解析を現在行っている。
②肝芽細胞欠損マウスの作出に集中したため、培養系の実験は期間内にほとんど行う事ができなかった。
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