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2012 年度 実施状況報告書

腎集合管水輸送におけるV1aRシグナル伝達分子の同定

研究課題

研究課題/領域番号 24790222
研究種目

若手研究(B)

研究機関北里大学

研究代表者

安岡 有紀子  北里大学, 医学部, 助教 (50348504)

研究期間 (年度) 2012-04-01 – 2015-03-31
キーワードV1aR / V1aR KOマウス / 腎集合管 / V2R / AP2
研究概要

本年度は、V1aR KOマウスの水電解質調節能の解析を行った。標準飼育時の血漿pH、pCO2、HCO3-、Na+・K+・Cl-濃度、浸透圧、クレアチニン、血漿バソプレッシン(VP)濃度の値は、WTとKOに差はなかったが、膀胱尿の浸透圧(mOsm/kgH2O)は、KOにおいて有意に低かった(WT 328.2、KO 322.3 (P < 0.05))。水電解質調節分子であるAQP2の発現量は、全腎においてKOで有意に少なく(western blotting)、KOの集合管管腔膜上のAQP2も少なかった(免疫染色および尿中AQP2の定量)。また、V2R mRNA量を高感度ISH (TSA-ISH)法により定量したところ、V2R mRNA量はKOで有意に少なかった(P < 0.005)。
次にWT、KOマウスを24時間絶水し、血液・尿成分を比較し、AQP2、V2Rの発現量を解析した。絶水時、血漿pH、pCO2、pO2、HCO3-濃度の値はWTとKOに差はなかったが、Na+・K+・Cl-濃度、血漿浸透圧、血漿VP濃度の値は、KOはWTより高く有意な差があった(絶水時、血漿浸透圧(mOsm/kgH2O): WT 342、KO 354 (P < 0.001)、 血漿VP濃度(pg/ml): WT 22.1、KO 48.8 (P < 0.001))。膀胱尿の浸透圧(mOsm/kgH2O)の値は、KOはWTより低く有意な差があった(WT 3610、KO 3361 (P < 0.05))。集合管のAQP2は、絶水でWT, KO共に管腔膜側へ移行したが、KOのAQP2発現量はWTより少なかった。また、V2R mRNAの発現量は、絶水でWTは増加したが、KOは増加しなかった。
V1aR KOマウスは、水電解質調節分子AQP2、V2Rの発現量が少なく、尿濃縮能が低下していることが明らかになった。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成24年度は、1. V1aR KOマウスの水電解質調節能の解析、2. V1aR KOの水電解質調節分子の解析、3. アシドーシス誘導条件の検討、を計画した。
1. V1aR KOマウスの水電解質調節能の解析:標準飼育下のWTとKOの血液・尿成分の比較を行い、標準飼育下では有意な差がないことを示した。また、水電解質調節分子AQP2、V2Rの発現量を免疫染色法、western blotting法、TSA-ISH法により調べ、KOで有意に少ないことを示すことが出来た。(達成度100%)
2. V1aR KOの水電解質調節分子の解析:WT、KOマウスを24時間絶水し、水電解質調節分子を解析した。絶水時、全腎におけるAQP2発現量、集合管管腔膜上のAQP2量はKOで有意に少ないことを示すことが出来た。また、V2R mRNA量は、絶水時WTでは増加するが、KOでは変化しないことを示すことが出来た。アシドーシス時における水電解質調節分子の解析は、平成25年度に行う予定である。(達成度80%)
3. アシドーシス誘導条件の検討:アシドーシス誘導の定法である0.28M NH4Cl飲水による酸負荷は血漿浸透圧、血漿VPを増加させ、脱水による反応が混在するため、NH4Cl飲水ではなく酸添加食によるアシドーシス誘導を検討した。2.5% NH4Cl添加食は、血漿浸透圧、血漿VPの増加を抑え、アシドーシスを誘導出来ることを確認した。(達成度100%)

今後の研究の推進方策

V1aRシグナルを解明するために、引き続きV1aR KOマウスを用い、WTマウスと比較する。平成25年度は、アシドーシス時にAQP2の管腔膜への移行が阻害される機構についてV1aRシグナルの関与を調べる。
・V1aR KOの水電解質調節分子の解析:アシドーシス時における腎集合管のAQP2発現量、細胞内局在、V2R mRNAの発現量を、免疫染色法、western blotting法、TSA-ISH法により調べる。また、血液・尿成分を比較する。
・V1aR発現量が変化する細胞の同定:アシドーシス誘導後の腎尿細管V1aRの発現量変化を解析する。発現量が変化した細胞において産生・放出される蛋白やイオンが、AQP2の発現や膜移行に関与する可能性がある。
・アシドーシス時のV1aR KOの血漿、尿成分、水電解質調節関連分子の解析:集合管V1aRは尿酸性化を担う間在細胞に発現しているため、アシドーシス時の血漿、尿成分をWTとKOで比較し、違いがあるか調べる。また、AQP2の発現を制御すると考えられている分子(アルドステロン、インスリン等(Hasler U, et al. Am J Physiol. 2009))についても、発現量を比較する。

次年度の研究費の使用計画

1. V1aR KOの水電解質調節分子の解析:アシドーシスは2.5% NH4Cl食負荷(6日間)により誘導する。イソフルレン麻酔下で採血後、腎臓を摘出し、右腎は蛋白精製用に採取し、左腎は組織化学的解析用にパラフィン包埋する。V2R mRNAの発現量はTSA-ISH法、AQP2蛋白の発現量はwestern blotting法により定量し、AQP2細胞内局在は免疫染色法、尿中AQP2量により解析する。
2. V1aR発現量が変化する細胞の同定:アシドーシス誘導後、WTマウスの腎V1aR発現量を尿細管の部位別、細胞別にTSA-ISH法によって定量し、標準飼育時のV1aR発現量と比較する。
3. アシドーシス時のV1aR KOの血漿、尿成分、水電解質調節関連分子の解析:アシドーシス誘導後、採血した血液成分の血漿pH、HCO3-、pCO2、電解質濃度、浸透圧、クレアチニン、血漿VP、アルドステロン、プロスタグランジン量等について測定する。尿成分は、pH、アンモニア排泄量、電解質濃度、浸透圧、尿中クレアチニン量、尿中VP量等を測定する。WTとKOに違いがあるか比較する。AQP2の発現を制御すると考えられているアルドステロン、インスリン、TNFα、CREB (cAMP-responsive element binding protein)、AP-1 (activator protein 1)、NF-kBなどの遺伝子、蛋白の発現量 (TSA-ISH法、real-time PCR法、western blotting法)を解析する。WTとKOに違いがあるか比較する。

  • 研究成果

    (10件)

すべて 2013 2012 その他

すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件) 学会発表 (5件) 図書 (1件)

  • [雑誌論文] Decreased expression of aquaporin 2 in the collecting duct of mice lacking the vasopressin V1a receptor.2013

    • 著者名/発表者名
      Yasuoka Y, Kobayashi M, Sato Y, Nonoguchi H, Tanoue A, Okamoto H, Kawahara K.
    • 雑誌名

      Clin Exp Nephrol.

      巻: 17 ページ: 183-190

    • DOI

      10.1007/s10157-012-0686-3.

    • 査読あり
  • [雑誌論文] The intercalated cells of the mouse kidney OMCDis are the target of the vasopressin V1a receptor axis for urinary acidification.2013

    • 著者名/発表者名
      Yasuoka Y, Kobayashi M, Sato Y, Zhou M, Abe H, Okamoto H, Nonoguchi H, Tanoue A, Kawahara K.
    • 雑誌名

      Clin Exp Nephrol.

      巻: - ページ: -

    • DOI

      -

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Activation of TRPA1 by luminal stimuli induces EP4-mediated anion secretion in human and rat colon.2012

    • 著者名/発表者名
      Kaji I, Yasuoka Y, Karaki S, Kuwahara A.
    • 雑誌名

      Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.

      巻: 302 ページ: G690-701

    • DOI

      10.1152/ajpgi.00289.2011.

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Functional Recovery of a Whole Ovary Transplanted Into Syngenic Testis in Mice.2012

    • 著者名/発表者名
      Sato M, Ohtsuka M, Nakamura S, Sakurai T, Watanabe S, Yasuoka Y.
    • 雑誌名

      Cloning & Transgenesis

      巻: 1 ページ: 102

    • DOI

      10.4172/2168-9849.1000102

    • 査読あり
  • [学会発表] 尿濃縮におけるバソプレシンV1a受容体の役割

    • 著者名/発表者名
      安岡有紀子、佐藤雄一、野々口博史、田上昭人、河原克雅
    • 学会等名
      第55回日本腎臓学会学術総会
    • 発表場所
      横浜
  • [学会発表] 腎近位尿細管Kチャネル(TASK2)の酸塩基調節における役割

    • 著者名/発表者名
      安岡有紀子、大塚正人、佐藤雄一、木村穣、河原克雅
    • 学会等名
      第42回日本腎臓学会東部学術大会
    • 発表場所
      新潟
  • [学会発表] Upregulation of mice carbonic anhydrase XII in the α-intercalated cell of outer medullary collecting duct during acidosis.

    • 著者名/発表者名
      Yukiko Yasuoka, Yuichi Sato, Hiroshi Nonoguchi and Katsumasa Kawahara.
    • 学会等名
      アメリカ腎臓学会
    • 発表場所
      サンディエゴ
  • [学会発表] A role of Ca-sensing receptor (CaSR) expressed in type B intercalated cells along the mouse kidney collecting duct.

    • 著者名/発表者名
      安岡有紀子、佐藤雄一、河原克雅
    • 学会等名
      第90回日本生理学会大会
    • 発表場所
      船橋
  • [学会発表] Metabolic acidosis caused by insufficient vasopressin V1a receptor in kidney collecting duct.

    • 著者名/発表者名
      河原克雅、安岡有紀子
    • 学会等名
      第90回日本生理学会大会
    • 発表場所
      船橋
  • [図書] 腎と透析 特集:水代謝の基礎と機能障害、水の調節機構2012

    • 著者名/発表者名
      河原克雅、安岡有紀子
    • 総ページ数
      6
    • 出版者
      東京医学社

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公開日: 2014-07-24  

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