| 研究課題/領域番号 |
24790291
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| 研究機関 | 愛知学院大学 |
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研究代表者 |
平居 貴生 愛知学院大学, 歯学部, 講師 (80389072)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | BMP4 |
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| 研究実績の概要 |
軟骨内骨化において、副甲状腺関連ペプチド（Parathyroid hormone related peptide; PTHrP）はPTH/PTHrP受容体に結合して、軟骨細胞増殖・肥大化を制御していることが明らかとなっている。本研究では、静止軟骨細胞における未分化維持機構におけるPTH/PTHrP受容体シグナルの関与の可能性について検討することを目的とした。これまでの研究成果より、PTH/PTHrP受容体コンディショナルノックアウト（cKO）マウスを中心とした解析の結果、PTH/PTHrP受容体シグナルは静止軟骨細胞の未分化維持に関与していることが示唆された。また、生後３日目の新生児の関節部位から酵素処理法によって軟骨細胞の培養後、PTHrP刺激をおこない、刺激後１時間から８時間目までのtotal RNAを回収し目的遺伝子の変動をマイクロアレイ法、リアルタイムPCR法を用いて解析した結果、PTHrP（1 nM）刺激後１時間目から転写因子Nuclear Factor, Interleukin 3 Regulated/ E4 Promoter-Binding Protein（Nfil3/E4BP4）mRNAが有意に増加することが明らかとなった。近年、時計遺伝子として同定されたNfil3/E4BP4は、T細胞の分化決定に必須な転写因子であることが報告されている。我々は、この転写因子Nfil3/E4BP4に着目し解析した結果、軟骨代謝に重要な役割を果たす骨関連因子BMP4遺伝子の発現を負に制御することを明らかにした。また、シクロオキシゲナーゼ２をコードするPTGS2がNfil3/E4BP4の標的遺伝子の一つであることを明らかにし、Nfil3/E4BP4は時計遺伝子群（Bmal1あるいはPeriod）と協調的にPTGS2の発現を制御していることが判明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成26年度は、PTH/PTHrP受容体シグナルの標的分子の探索とその生理的意義の解析において進展があった。特に、PTHrP（1 nM）刺激によって誘導される転写因子Nfil3/E4BP4に着目した結果、骨組織におけるNfil3/E4BP4の機能的役割の一端を明らかにすることができた。時計遺伝子Nfil3は骨関連因子PTGS2のプロモーター上のDboxに結合しPTGS2の発現を負に制御することを明らかにした。すなわち、PTH/PTHrP受容体シグナルによって制御される分子としてBMP4あるいはCOX2が同定されたが、これら分子の制御には時計遺伝子が関与することが明らかとなった。一方、【軟骨スフェロイド培養法】を用いたPTH/PTHrP受容体シグナルの解析に関しては、培養法の確立において一定の成果があった。特定の条件において、静止軟骨細胞が三次元スフェロイド培養法によって細胞塊を形成することが明らかとなっている。これら細胞塊の特徴と、本研究によって明らかになったPTH/PTHrP受容体シグナルに標的分子の役割については現在解析中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
近年、Per2-lucマウスより摘出した骨標本を培養した場合、２４時間のリズミックな発光を示すなど、時計遺伝子による軟骨代謝の制御の可能性が示唆された。したがって、これまでの研究計画に加え、本研究目的達成のために、PTH/PTHrP受容体シグナルによって制御される「概日時計」と骨軟骨代謝との関わりについて新たに検討する予定である。また、PTH/PTHrP受容体シグナルの標的分子であるNfil3/E4BP4の個体レベルでの機能解析のために、現在はNfil3遺伝子欠損（KO）マウスの解析を進行中である。転写因子Nfil3/E4BP4は標的遺伝子のプロモーター上に結合し、標的遺伝子の発現を負に制御することが知られているが、今後はPTHrP刺激によって発現するNfil3/E4BP4がA Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin-5 motif (ADAMTS5) ADAMTS5遺伝子発現を直接制御するか否かについて詳細に検討する予定である（昨年度までの研究成果によって、軟骨細胞に対するPTHrP刺激によって、ADAMTS5 mRNAの有意な発現減少を確認している）。また。ADAMTS5は変形性関節症や関節炎における関節破壊に中心的な役割を担っていることがADAMTS-5 KOマウスを用いた実験で証明されているが、その制御機構については不明な点が多く残されている。すなわち、Nfil3 KOマウス解析によって、Nfil3/E4BP4によるADAMTS-5遺伝子の制御機構を明らかにする。これらの実験計画に加え、PTHrP刺激によって変動する遺伝子群のなかで、生理的に意義深い分子に関しては、細胞生物学的解析によって、さらに詳細に解析していく予定である。
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