研究課題/領域番号 |
24790325
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研究機関 | 獨協医科大学 |
研究代表者 |
井上 健一 獨協医科大学, 医学部, 講師 (90587974)
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研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2017-03-31
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キーワード | microRNAクローニング / 次世代シーケンサー |
研究実績の概要 |
前年度作成した改良型アプタマーtRSA-RUNX-UTRを神経芽細胞株に遺伝子導入し、予定していたmicroRNAクローニングを試みた。しかしながら、結合したmicroRNAをプライマーとしてcDNAを合成する当初のプロトコルでは、得られた大腸菌クローンに陽性が得られなかった。形質転換の過程で、一定以上のコピー数が必要であることが原因と考えられる。また、RUNX-UTRに細胞死の効果があるため、生細胞の数を確保できないことも、感度低下の原因と推測する。 感度の問題を克服するため、最初にmicroRNAのプロファイルを作成し、そのリストからPCRで増幅して絞り込む方針に転換した。 細胞株のmicroRNAのプロファイリングを目的として、small RNAのシーケンシングを行った。得られたリストのプライマーを作成して、PCRで絞り込みを行った。 いくつかの候補が挙がっているため、最終年度機能解析を行う。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
前年度のトラブルシュートでアプタマーの安定性は改善したが、予想通り結合するmicroRNAをクローニングするには感度が十分ではないことが分かった。 より感度の高いRT-PCR法で同定するため、候補遺伝子のリスト作成のために次世代シーケンサーを使用し、絞り込んだ。 細胞種により異なるリストが得られ、妥当性検証に時間が掛かった。
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今後の研究の推進方策 |
候補microRNAとRUNX1/3の関係を機能実験で検証する。 候補microRNAの腫瘍抑制/がん遺伝子の機能を調べる。
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次年度使用額が生じた理由 |
年度内試薬類は足りており、少額なので使用しなかった。
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次年度使用額の使用計画 |
microRNAの機能実験を行う。
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