ＧＥＭ小体に着目した運動神経細胞死の機序の解明

2012 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24790875
• 研究種目: 若手研究(B)
• 研究機関: 新潟大学
• 研究代表者: 横関 明男 新潟大学, 医歯(薬)学総合研究科, 特任准教授 (90515719)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: TDP-43 / ALS / GEM / SMN

研究概要

筋萎縮性側索硬化症(ALS)の発症に強く関与する核内蛋白であるTDP-43の発現低下により，核内小体の一つであるGEM小体の構成蛋白であるSMN(survival motor neuron)の動態の変化を確認するため，下記の実験を行った．
1.TDP-43の発現抑制によるSMN小体数の変化　核内小体の研究で広く使用されているHeLa細胞を用いて，TDP-43をsiRNAで発現を抑制し，抗体SMN抗体で免疫染色し，蛍光顕微鏡で観察してSMN小体の数を計測した．コントール，およびTDP-43発現抑制細胞それぞれ200細胞ずつ観察し，1細胞あたりのSMN小体の数を計測した．コントロール，2.97±0.127(平均±標準誤差)；TDP-43抑制細胞，1.54±0.93であり，TDP-43の発現が低下すると，SMN 小体の数が減少することを明らかとした(P<0.001，Mann-Whitney’s U test).
2.TDP-43の発現抑制によるSMN蛋白量の変化　上記細胞を用いて，ウエスタンブロット法で，SMNの蛋白量の変化を確認した．TDP-43の発現抑制を抑制すると，SMN蛋白量が低下することを明らかとした．
3.疾患関連変異TDP-43の細胞内動態の解析　14種類の疾患関連変異および野生型TDP-43をC6細胞にトランスフェクションし，可溶性画分であるTris画分と不溶性画分であるSDS(sodium dodecyl sulfate)画分に分画化し，ウエスタンブロットを行った．Tris画分と比較してSDS画分に断片化されたTDP-43が多く検出されたが，野生型と変異型との間では違いは見いだせなかった．
上記の結果から，TDP-43の発現量が低下すると，SMNの数および蛋白が低下することを明らかとした．

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

TDP-43の発現低下が，RNA代謝に関与する核内小体に影響を与えることを，培養細胞を用いて証明することができたため，平成24年度の実施すべき目標は概ね実施することができたと考える．

今後の研究の推進方策

平成24年度の研究で，培養細胞を用いて証明したSMNの低下が，ALS症例で生じているか否かを確認するため，剖検検体を用いて確認する．具体的には，弧発性ALSおよび神経変性疾患を合併していないコントロールの脊髄前角細胞を用いて，抗体SMN抗体による免疫染色，ウエスタンブロットを行い，SMNの数，量を確認する．またSMN小体の体積も，画像解析ソフトを使用して解析する予定である．

次年度の研究費の使用計画

上記研究を実施するにあたり，免疫染色の抗体や試薬，細胞への遺伝子導入やsiRNAなどの消耗品，シークエンス関連試薬，細胞培養の試薬などの消耗品の購入を行う予定である．

研究成果

• [雑誌論文] Japanese amyotrophic lateral sclerosis patients with GGGGCC hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 (2013)
  • 著者名/発表者名: Konno T, Shiga A, Tsujino A, Sugai A, Kato T, Kanai K, Yokoseki A, Eguchi H, Kuwabara S, Nishizawa M, Takahashi H, Onodera O
  • 雑誌名: J Neurol Neurosurg Psychiatry 巻: 84 ページ: 398-401
  • DOI: 10.1136/jnnp-2012-302272
  • 査読あり
• [雑誌論文] Alteration of POLDIP3 splicing associated with loss of function of TDP-43 in tissues affected with ALS (2012)
  • 著者名/発表者名: Shiga A, Ishihara T, Miyashita A, Kuwabara M, Kato T, Watanabe N, Yamahira A, Kondo C, Yokoseki A, Takahashi M, Kuwano R, Kakita A, Nishizawa M, Takahashi H, Onodera O
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 7 ページ: e43120
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0043120
  • 査読あり
• [備考] 新潟大学脳研究所 神経内科 研究紹介
  • URL: http://www.bri.niigata-u.ac.jp/~neuroweb/laboratory/research_basic_002.html