| 研究概要 |
モデル動物にウイルスベクターを直接投与(in vivo)し、骨格筋および心筋細胞に治療用遺伝子（ジストロフィン遺伝子）を導入し長期間（１年間）の遺伝子発現を観察し、病理学的、生理学的機能評価により有効性の検討を行った．
具体的には，マーカー遺伝子(eGFP)，複数の短縮型dystrophinとdystrophin/eGFP fusion 遺伝子を発現カセットにサブクローンし，シーケンシング，HEK293細胞などで蛋白を発現し，FACS，western blotting，免疫染色などで確認を行い，Lentivirus vector作成用カセットに挿入した．発現コントロールはCMV, MSCV, CAGなどの非特異的プロモーター以外に骨格筋特異的なHuman Skeletal α-Actin gene promoter (HSA)などを用いた．プラスミドを大量精製後，パッケージング用プラスミド２種（pCMV-VSVG-RSV-Rev, pCAG-HIVgp: 三好等の方法），ないし３種（pRSV-REV, pCMV-VSVG, pRRLsin.cPPT-X-PRE: Naldini等の原法）とともにHEK293T細胞にトランスフェクションし超遠心法によってウイルス液を濃縮精製した．
直接、モデル動物 (mdxマウス) にa) 直接筋注、b) 腹腔内投与を行った．接種後1年（および2年）を観察期間として、治療効果を判定した．全例で骨格筋病理標本を作製しHE染色，m-Gomori染色など通常の染色方法に加え．抗dystrophin抗体染色，GFP（直接観察、必要に応じて抗GFP抗体を使用），dystrophin 関連タンパクを染色し評価した．また生理学的評価として骨格筋の収縮性・耐性の評価としてspecific forceとcontractionに対する耐性試験を行った．
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