研究課題
モデル動物にウイルスベクターを直接投与 (in vivo) し，骨格筋および心筋細胞に治療用遺伝子 (ジストロフィン遺伝子) を導入し長期間の遺伝子発現を観察し，病理学的，生理学的機能評価により有効性を検討した．具体的にはマーカー遺伝子 (eGFP) ，複数の短縮型dystrophinとdystrophin/eGFP fusion 遺伝子を発現カセットにサブクローンし，シーケンシング，HEK293細胞などで蛋白を発現し，FACS，western blotting，免疫染色などで確認を行い，Lentivirus vector作成用カセットに挿入した．発現コントロールはCMV, RSV, CAGなどの非特異的プロモーター以外に、骨格筋特異的なHuman Skeletal α-Actin gene promoter (HSA), CK6 (modified Creatinin Kinase) などを用いた．プラスミドを大量精製後，パッケージング用プラスミド２種 (pCMV-VSVG-RSV-Rev, pCAG-HIVgp: 三好等の方法) ，ないし３種 (pRSV-REV, pCMV-VSVG, pRRLsin.cPPT-X-PRE: Naldini等の原法) とともにHEK293T細胞にトランスフェクションし，超遠心法によってウイルス液を濃縮精製した．直接，モデル動物 (mdxマウス) にa) 直接筋注，b) 腹腔内投与を行った．接種後4週，4ヶ月，1年，2年を観察期間として，治療効果を判定した．骨格筋病理標本を作製しHE染色、mGomori染色など通常の染色方法に加え，抗dystrophin抗体染色，GFP (直接観察，必要に応じて抗GFP抗体を使用) ，dystrophin 関連タンパクを染色し評価した．また生理学的評価として骨格筋の収縮性・耐性の評価としてspecific forceとcontractionに対する耐性試験を行った．
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