| 研究課題/領域番号 |
24790904
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
白石 裕一 長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (40423644)
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| キーワード | アセチルコリン受容体 |
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| 研究概要 |
従来，抗AChR抗体の検出にはradioimmunoprecipitation assay (RIA)法が汎用されてきたが，最近RIA法の検出感度を上回るcell-based assay (CBA)が注目されている．高感度抗AChR抗体測定法により全身型seronegative MGの約７０％がaffinityの低い抗AChR抗体をもつことが示された． CBAの場合は，検査結果の定量性という点で困難さを包含しており，我々は，従来法とは異なるカイアシルシフェラーゼ免疫沈降法（GLIP法）による抗AChR抗体測定法の開発を計画した．
ヒト筋肉型ニコチン性AChRを構成する５つのサブユニット（α1, β1，γ，ε，δ）cDNAとカイアシルシフェラーゼ（GL）cDNAを制限酵素部位により連結（アミノ末端側に各サブユニットcDNAを，カルボキシル末端側にGL cDNAを配置）し，各AChRサブユニットに関するリポーターの作製を行った．さらに，作製したリポーターcDNAを哺乳動物細胞遺伝子発現ベクター（pcDNA3.1）に組込んだ． AChRサブユニット特異的リポーター発現ベクターをヒト細胞株・293Fに遺伝子導入し，その発現を生化学的に確認するとともに，GL活性の確認も行った． 各AChRサブユニットに対する既製抗体を入手し，各リポーターを使用したGLIPを実施し，GLIP法が成立する確認作業に取り組んだ．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
各AChRサブユニットに対する既製抗体を入手し，各リポーターを使用したGLIPを実施した．現時点で十分に検出感度がすぐれているとは言えず，検証作業を行っている．これと並行し， cell based assayによる高感度抗AChR抗体測定法に着手した．方法は，①HEK293細胞にAChRα，β，δ，εサブユニットとラプシンをtransfectionし，細胞表面にAChRを高密度に発現させる．②患者血清を加え，ホルマリンで固定後，二次抗体（Goat anti-human IgG Alexa Fluor568）を加える ③蛍光顕微鏡で評価を行う．①～③の準備は整い，assayを開始する．
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| 今後の研究の推進方策 |
Cell based assayによる高感度AChR抗体測定を行うとともに，Grip法での問題点を解決する．MuSK，Lrp4抗体を含めて，包括的にMG関連自己抗体測定を行い，その臨床的特徴を明らかにする．
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