2016 年度実施状況報告書

血小板造血および血小板機能シグナルにおけるＲＵＮＸ１の役割の解明

研究課題

研究課題/領域番号	24790979
研究機関	宮崎大学
研究代表者	下田晴子宮崎大学, 医学部, 医員 (10452921)
研究期間 (年度)	2012-04-01 – 2018-03-31
キーワード	血小板造血 / 血小板機能
研究実績の概要	家族性血小板減少症/白血病（Familial Platelet Disorder with propensity to develop Myeloid Malignancy, FPD/MM)は幼少時より血小板減少および血小板機能異常を呈し、高率に急性骨髄性白血病または骨髄異形性症候群を発症する常染色体優生遺伝の家族性疾患である。FPD/MMの原因として正常造血を制御する転写因子RUNX1の異常が同定されている。当研究ではFPD/MMの患者を通して、RUNX1の異常が血小板減少および血小板機能異常をもたらすメカニズムについて明らかにすることを目的にしている。当研究室では、臨床でFPD/MMと考えられる3家系(A,B,C)を経験した。そのうち家系Aの患者らには、共通してRUNX1のエクソン1近傍にアリル欠失があることを同定した。したがって、家系AについてはRUNX1の片アリル欠失によるhaploinsufficiency が疾患の原因と考えている。現在、家系Aの患者らで実際にRUNX1のmRNA発現量が低下しているかどうか確認をすすめている。家系Bについては、RUNX1の遺伝子配列に異常はなかったため、家系Bも家系Aと同様のRUNX1の量的異常を考えて実験をすすめている。家系Cについては、現在患者のインフォームドコンセントを得てサンプリングをすすめているところである。この研究は、３つの異なるFPD/MM家系の患者らにおいて、それぞれの家系のRUNX1の異常をそれぞれに同定し、患者らのサンプルを用いることで生体レベルでRUNX1の血小板造血および血小板機能における役割を解明できる可能性があることに意義がある。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 4: 遅れている理由 H24年8月14日より産前産後の休暇および育児休業を取得し研究を中断した後、H27年12月1日より研究を再開した。研究中断前と再開後の実験結果の一致（再現性）を確認するのに時間を要した。また、本研究課題に関わる新しい知見が次々と報告されており、それらの情報収集し研究の方向性を確認していくのにも時間を要している。
今後の研究の推進方策	今後も引き続き以下1,2の実験をすすめる。１．RUNX1が血小板凝集に関与しているかどうかの検討 RUNX1がGPⅡb-Ⅲa複合体の活性化経路を制御している可能性を検討する。まず、血小板の遺伝子発現プロファイリングを行い、患者と健常人との間で発現レベルに差異のある遺伝子をスクリーニングする。スクリーニングの結果よりGPⅡb-Ⅲa活性化経路に関与する可能性のある候補を絞り、それらの候補について以下①②を検討する。①血小板での蛋白量が減少しているかどうか（血小板から蛋白を抽出し、ウエスタンブロットを行う)②RUNX1の転写標的となっているかどうか（ルシフェラーゼアッセイを行う）２．RUNX1が血小板造血に関与しているかどうかの検討 RUNX1が造血細胞の分化段階に応じてTPO-cMPLシグナル伝達経路を制御している可能性を検討する。まず、家族性血小板減少症患者の骨髄細胞を造血幹細胞（最も未熟な段階）から巨核球・血小板（最も分化した段階）に至るまでの各分化段階の細胞に分け（セルソーターを利用）、それぞれの分化段階の細胞集団について以下①②③を比較する。①細胞表面cMPL発現量(FACS)②mMPLの転写レベル(RT-PCR)③TPO刺激によるSTAT5のリン酸化の程度(Western blot）