研究課題
申請者らは、ダニの外殻構成成分であるキチンが、Th2サイトカイン誘導因子であるIL-33を介して、IL-4/13-STAT6依存的なアレルギー応答を誘導することを見出した。そこで、ダニによるアレルギー性疾患発症機構を明らかにするため、キチンによるアレルギー応答誘導機構について検討した。(1)キチンおよびIL-33の標的細胞の同定と活性化機構の解明キチンはIL-33存在下でのみ骨髄細胞由来樹状細胞(BMDC)を活性化することを見出している。したがって、キチン・IL-33刺激により活性化した樹状細胞がTh2応答誘導に関わっている可能性がある。そこで、キチン・IL-33で刺激したBMDCと、OVA特異的T細胞受容体を発現するOTIIマウスのCD4+ヘルパーT細胞を、OVAペプチド存在下で共培養した。その結果、IL-33・キチンで刺激したBMDCは、ヘルパーT細胞によるOVA依存的なTh2サイトカイン産生を有意に増強した。したがって、キチンは、IL-33依存的な樹状細胞の活性化を介して、アレルギー応答を誘導していると考えられる。(2)キチン受容体の同定およびキチン受容体のシグナル伝達経路の解明キチンの受容体として、TLR2及びDectin-1が報告されていることから、IL-33存在下でのキチンによるBMDCの活性化に、これらの受容体が関わることが想定される。そこで、野生型マウス、TLR2欠損マウス及びDectin-1欠損マウス由来BMDCを、キチン・IL-33で刺激した。その結果、いずれのマウス由来BMDCも同レベルの炎症性サイトカインを産生した。したがって、キチンによる樹状細胞の活性化には、TLR2及びDectin-1とは異なる、新規受容体が関与すると考えられる。
3: やや遅れている
申請書の研究計画において１．キチン及びIL-33の標的細胞の同定と活性化機構の解明、２．キチン受容体の同定およびシグナル伝達経路の解明を目的としている。１．に関して、キチンの標的細胞の一つである樹状細胞は、IL-33存在下でキチンによる刺激を受けると、抗原特異的なTh2細胞の活性化を増強できることを明らかにした。しかしながら、キチンにより特異的に誘導され、Th2細胞の活性化に関与する樹状細胞由来のサイトカインや共刺激分子などのメディエーター探索が終了していないため。また、２．に関して、TLR2及びDectin-1以外の新規受容体が、キチン・IL-33による樹状細胞の活性化に関与する可能性が示唆されているが、新規受容体の同定には至っていないため。
１．キチン及びIL-33の標的細胞の同定と活性化機構の解明に関して、キチン・IL-33刺激により活性化した樹状細胞が、Th2細胞の活性化を増強することを明らかにした。この機構には、キチン・IL-33刺激により樹状細胞に発現が誘導されるサイトカインや共刺激分子が関与すると考えられる。今後は、Th2細胞の活性化に関わる、樹状細胞由来のメディエーターを明らかにし、さらには、樹状細胞欠損マウス（CD11c-DTRマウス）に、野生型もしくはメディエーター欠損樹状細胞を移入再構築したマウスにおいて、OVA・キチンによるアレルギー性気道炎症の評価を行う。２．キチン受容体の同定およびシグナル伝達経路の解明に関して、TLR2及びDectin-1以外の新規受容体が、キチン・IL-33による樹状細胞の活性化に関与する可能性が示唆されている。キチン受容体はキチン結合性を有していると想定されることから、肺及びBMDC中のキチン結合タンパク質を、キチンビーズカラムを用いて精製及び同定する。さらに、同定されたキチン結合タンパク質について、siRNAもしくは遺伝欠損マウス由来BMDCを用いて機能解析を行い、樹状細胞の活性化に関わるキチンの機能的受容体を同定する。最終的には、キチン受容体遺伝子欠損マウスにおいて、OVA・キチンによるアレルギー性気道炎症の評価を行う。
キチンの効果を評価するため、野生型マウス数約300 匹（\2000×300 = \60万）を購入する。マウスに対するキチンの効果を評価するために、IL-4、IL-17、IFN-g、IL-1b、IL-33の5 種のサイトカイン測定キット（\10万×5 = \50万）を購入する。マウス骨髄細胞からBMDCを誘導するため、rmGM-CSF 1 mg（\40万）を購入する。BMDCへのsiRNA導入のため、特異的なsiRNAとトランスフェクション試薬（\10万）を購入する。
すべて 2013 2012
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