マウスモデルにおける低用量放射線および樹状細胞を用いた放射線免疫療法の確立

2012 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24791323
• 研究種目: 若手研究(B)
• 研究機関: 名古屋市立大学
• 研究代表者: 河合 辰哉 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70597822)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 放射線治療 / 免疫治療

研究概要

目的：マウス腫瘍モデルの確立と放射線照射によるマウス免疫系細胞のpopulation解析。
方法：1．マウスC57/BLに対してマウス上皮系悪性腫瘍（SCCVII）を大腿部皮下に注射し，適切な接種量を検討した。2．非腫瘍移植マウスを用いて免疫系細胞の集団解析を行った。7週齢のマウスC57/BLに対してX線の単回全身照射（500 mGy，50 mGy，0 mGy）を施行し8週齢時に脾臓，胸腺およびリンパ節を摘出した。それぞれより浮遊細胞を調製し，蛍光標識抗表面抗原抗体（CD3，CD4，CD8α，B220，Dx5，CD44，CD62L，IgM，CD25）を用いて標識しフローサイトメトリーによる解析を行った。
結果：1．腫瘍生着率は1x105個で75％，4x105個で100％，いずれも6週を越える生存期間であった。2．50 mGy照射群で，脾臓およびリンパ節においてCD44-CD62L+とCD44+CD62L-の逆転（CD62L+の相対的上昇）が見られた。50 mGy，500 mGy照射群で，脾臓，リンパ節におけるCD3+Dx5+およびCD3-Dx5+の低下が認められた。500 mGy群で脾臓におけるCD4+CD25+の比率上昇が認められた．
500 mGy群でリンパ節CD4細胞の相対的増加が見られた他，脾臓，リンパ節，胸腺T細胞のCD4/CD8比に変化は認められなかった。胸腺細胞のdouble negative, double positive T cellいずれも有意な変化は認められなかった。500 mGy群でリンパ節，脾臓，リンパ節のIgM陽性B細胞の増加が見られたが，その他CD3-B220+細胞，B220+IgM+細胞に変化は認められなかった。
結論：マウスにおいて低用量放射線照射が抗腫瘍環境に対して何らかの影響を及ぼす可能性が示唆された．

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

予定通りマウス免疫系細胞の表面マーカーによる集団解析を施行した。当初の計画では，これら免疫担当細胞の産生するサイトカインについても解析を行う予定であったがこちらは現在進行中である。遅延の理由としては，フローサイトメトリーで統計学的に必要な検体数を調製，解析するのに時間を要したこと，サイトカイン解析ではRNAの抽出，real time PCRにおいて適切な細胞数の決定や試薬の調製で最適な条件を網羅的に検索する必要があったことが挙げられる。

今後の研究の推進方策

今後は引き続きマウス免疫担当細胞を用いて表面マーカー解析，サイトカイン解析を行い，腫瘍接種群と非接種群での違いや照射線量による変動を観察する。具体的には，今回明らかになったNK細胞，NKT細胞をはじめとする，放射線感受性が高いと考えられる細胞およびこれらに影響を与えると考えられるCD4陽性Th細胞およびCD25+Foxp3+制御性T細胞を対象としたフローサイトメトリーによる細胞集団解析，また，細胞性免疫や液性免疫に関与するサイトカイン産生についてreal time PCRを用いた発現量解析を行う予定である。
次に，マウス樹状細胞の確立のための予備実験として，マウスの下肢より骨髄細胞を回収し，その骨髄細胞をin vitroでGM-CSF＋IL-4で刺激し未熟樹状細胞を誘導する。さらに，PGE2＋OK432で成熟樹状細胞に分化させ，得られた樹状細胞の質について表面マーカー（CD11c，B220，CD8α，CD80，CD86、CD40，CD54，MHC-I，MHC-II）やサイトカイン（TNFα，IL-12，IL-10）を調べ，Th1を誘導できる樹状細胞の作成を試みる。さらに次年度以降の予定としては，研究計画に従って樹状細胞を併用した放射線療法における抗腫瘍効果の検討，各種ノックアウトマウスを用いた，本治療法における生体内免疫系環境の変化の特徴付けを行う。

次年度の研究費の使用計画

次年度繰越金（793,867）および予定額交金（600,000）は，主に実験に必要な器具，試薬の購入に充てる予定である．サイトカイン遺伝子発現解析において使用頻度の高い備品として卓上遠心分離器（190,000），UVトランスイルミネータ（200,000），電気泳動装置（45,000）を購入予定である．またPCR，リアルタイムPCR関連試薬（100,000）も消耗品として必要である．さらに，細胞表面抗原による細胞集団解析の効率や正確性を高めるため，新たにFACS解析ソフトウエア（400,000）を導入したい．その他マウス（50,000～100,000），各種消耗品（20,000～50,000）が挙げられる．その他学会発表資料作成や旅費に使用予定である．

研究成果

• [学会発表] マウス免疫系における低用量放射線の影響 －Preliminary study－
  • 著者名/発表者名: 河合辰哉，芝本雄太
  • 学会等名: 第18回国際癌治療増感研究会
  • 発表場所: 大阪大学（大阪府）