| 研究課題/領域番号 |
24791518
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 帝京平成大学 |
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研究代表者 |
水谷 晃子 帝京平成大学, 健康メディカル学部, 講師 (80465252)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 成長ホルモン / 分泌 / 下垂体 / 相互作用 |
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| 研究概要 |
本研究は、我々が見出したヒト成長ホルモン（hGH）と酵素タンパク質（以下Protein Xと称する）間の相互作用を基盤として、ホルモン分泌を制御することが可能な相互作用抑制ペプチドを創出することによって、特に成長ホルモン産生腫瘍の新たな分子標的治療への創薬シーズを確立することを最終目標とする。当該年度は(i)相互作用表面の同定とマッピング、及び(ii) Protein XのhGH分泌に対する役割の解明、の２点に重点を置いて実験を行った。
(i)については、 まずhGHとProtein Xを大腸菌内で発現し、精製タンパク質間での相互作用を検討したところ、特異的な相互作用が検出され、hGHとProtein Xは直接相互作用することが示された。さらに相互作用領域のマッピングの結果、Protein Xの中央領域（約300 a.a.）がhGHとの相互作用に十分であことが判明している。相互作用領域の更なる絞込みと、相互作用に必須のアミノ酸残基の特定を現在進行中である。(ii)については、培養細胞株における外来性遺伝子の一過性発現は、発現レベルが不均一であることなどの問題があるため、安定的に蛍光タンパク融合型hGHを発現するマウスAtT-20細胞株を作製した。FACS解析の結果、樹立された細胞株のhGH融合型蛍光タンパクの発現強度はほぼ均一であり、各種分泌刺激に対する応答（細胞内局在の変化、hGHの細胞外への分泌）も確認されたため、hGH分泌実験に有用な細胞株であることが明らかとなった。この細胞株を用いて、siRNAによるProtein X発現抑制下におけるhGHの細胞内輸送、細胞外への分泌に及ぼす効果を検討したところ、hGHの細胞外分泌への影響が認められた。従って、Protein Xとの相互作用はhGHの分泌に重要であり、この相互作用の抑制はhGH分泌の抑制に繋がることが期待される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
hGHとProtein X 、２分子の直接的な相互作用を確認および相互作用に必要不可欠な領域を同定するために大腸菌で２つのタンパクの発現を試みたが、一部欠損型等野生型とは異なるタイプのタンパクの発現が想定よりも低く、精製に時間を要したため、必要不可欠なアミノ酸残基の同定を完結が困難となった。
安定株作成の過程において、不慮の事故が発生し樹立株の再構築を余儀なくされたため動態解析に遅れが生じた。
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| 今後の研究の推進方策 |
先の研究より得られたProtein Xの発現抑制におけるhGH分泌阻害は、hGHの一過性発現条件下で行われた実験であり、hGHそのものの発現量の不均一性が問題となる。そのため、今回新たに樹立した安定株を用いてProtein Xの発現抑制を行い、hGH分泌への影響を再検討する。
hGH発現安定株は、hGHの局在を示すマーカーとして蛍光タンパクが融合されているため、Protein X発現抑制時におけるhGHの分布および蛍光強度の変化をFACS、共焦点顕微鏡を用いて観察する。
２つのタンパクの相互作用領域の絞り込みをより厳密なものにするために、部分欠損体以外に、アミノ酸置換型、成長ホルモン分泌不全との関連が指摘されている変異型等のモデル系を作製し、２つの相互作用に必要不可欠なアミノ酸残基の特定を行う。
Protein Xの発現抑制が、TSHやACTHなど成長ホルモン以外の各種ホルモン分泌にどのような影響を与えるのか、ELISA法を中心に解析する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
hGHとProtein Xの相互作用表面の同定と高解像度マッピングに関する実験系は、平成２４年度中に相互作用表面の絞り込みが完了する予定であったが、大腸菌内における変異型タンパクの発現量の低下、相互作用を解析可能とするスケールの精製の困難さなどの理由により解析が遅れたものである。
本実験系を遂行するにあたり、各種変異体の作成のために突然変異の導入、作成後の塩基配列解析等に２４年度からの繰り越し分（次年度使用額）を充当する予定であり、H25年度研究実施予定分に関しては、予定通りH25年度予算を充当する予定である。
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