| 研究概要 |
インフォームドコンセントが得られた関節リウマチ患者から関節液を採取し、Guiducciらの方法 (Guiducci S, Arthritis Rheum, 2008)に準じ、はじめに1,500 Gで10分間遠心し上清を採取しました。再度、1,500 Gで5分間遠心し、残存している細胞成分を除去し、その上清を採取しました。その上清を、100,000 Gで20分間遠心し、遠心管の底に集まったpellet：微小粒子を取り出しました。そのpelletを専用のapop buffer (5mM KCl、 1 mM MgCl2、136 mM NaCl、pH 7.4)で溶解し、fluorescein isothiocyanate (FITC)-標識アネキシンV標識により、FACS解析と共焦点レーザー顕微鏡により微小粒子を確認しました。
また、申請者らがすでに確立した方法 (Takakubo Y, J. Rheumatol, 2008)で、関節リウマチ患者の関節液、末梢血、健常人末梢血からFicoll-Paquによりmononuclear cellを分離し、plasmacytoid DC (pDC)のマーカーであるBDCA4標識ビーズを添加、Auto MACSTM Separator (Miltenyi Biotec, Germany)によりpositive selection(正の選択)を行いました。分離したpDCは、FACS解析、サイトスピン（集細胞遠心装置）による蛍光免疫染色法により、pDC マーカーであるBDCA-2、CD123抗体を用い、pDCを確認しました。
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