| 研究概要 |
レミフェンタニルの単量体および二量体化オピオイド受容体の活性化・脱感作に与える影響をIn Vitroにて明らかにすべく、μ-δオピオイド受容体などの二量体化受容体の活性化シグナルのみを測定し、二量体化受容体の脱感作ならびに受容体細胞内移行を可視化した。
(1)二量体化オピオイド受容体のみのアッセイ
(1)クローン化μ受容体のC末端、ならびにδ受容体のC末端に蛍光波長の異なる蛍光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP; cyan fluorescent protein, CFP)をそれぞれ連結させた受容体を作製
(2)μ受容体、δ受容体活性を細胞内CaイメージングによりアッセイできるG蛋白キメラGqi5を連結
(3)これらの融合クローンをBaby Hamster Kidney細胞に発現
(1)(1)で作成したクローンを用いて受容体の細胞内局在を検討(免疫蛍光組織化学ならびに共焦点レーザによる受容体細胞内局在、
ウェスタンブロットによる受容体二量体化の確認)した。
(2)(2)で作成したクローンを用いて受容体刺激による細胞内カルシウム濃度上昇の可視化(カルシウムイメージング)を行い、さらにパッチクランプにて受容体活性を測定した。
(2)レミフェンタニルの二量体化オピオイド受容体への影響の解析
(1)で得られた、二量体受容体のみをアッセイできるシステムを用いて、レミフェンタニルの二量体化オピオイド受容体に対する反応性を比較解析するため、特に二量体化受容体に対する耐性形成様式の違いやメカニズムについて調査した。レミフェンタニル刺激前、細胞内移行後、リサイクリング後のμORとδORはいずれもFRETアッセイでヘテロ二量体を形成していた。高濃度レミフェンタニル刺激ではμOR、μ-δORのいずれもリサイクリングが阻害された。同じレミフェンタニル濃度では、μ-δORはμORよりリサイクリングされやすかった。以上より、μORおよびμ-δORのリサイクリンク障害が高濃度レミフェンタニルによる急性耐性の一因であり、μ-δORはμORより急性耐性を起こしにくい可能性が示唆された。
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